缺血后处理对缺血再灌注后海马CA1区神经元蛋白酶体活性的影响

杨 颖 王光明 徐 宁 葛鹏飞 罗毅男 (吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021)

缺血后处理对缺血再灌注后海马CA1区神经元蛋白酶体活性的影响

杨 颖 王光明 徐 宁 葛鹏飞 罗毅男 (吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021)

目的探讨缺血后处理对短暂脑缺血后海马CA1区神经元内蛋白酶体活性及氧化性蛋白质损伤的影响。方法采用大鼠全脑缺血模型。Wistar大鼠分为缺血组及缺血后处理组，每组按照再灌注时间进一步分为12 h恢复组，24 h恢复组，48 h恢复组及72 h恢复组。缺血后处理为在脑缺血结束后给予三个循环的30 s缺血和30 s再灌注处理。采用HE染色光镜观察脑缺血后神经元死亡;用Succinyl-LLVY-AMC作为底物检测蛋白酶体的活性变化;差速离心结合蛋白印迹分析蛋白酶体相关蛋白的表达。结果HE染色显示缺血后处理显著降低了脑缺血再灌注后海马CA1区神经元死亡;酶活性检测，缺血后处理使得蛋白酶体的活性显著提高;蛋白印迹分析显示，缺血后处理显著提高了蛋白酶表达。结论缺血后处理能够显著改善脑缺血后海马CA1区神经元内蛋白酶体的活性，降低了缺血再灌注后海马CA1区神经元死亡。

缺血后处理;脑缺血再灌注;蛋白伴侣hsp70;蛋白伴侣hsp40

缺血后处理是指在脑缺血结束后，反复地间断性阻断脑血流的恢复，进而达到脑保护的目的〔1〕。近年研究发现，缺血后处理(Ischemic postconditioning)对脑缺血再灌注所致的神经元延迟性死亡的保护作用与其能够降低氧化应激反应、激活细胞内的信号传导途径有关〔2，3〕，但是其对脑缺血再灌注过程中蛋白酶体的影响尚不清楚。以往研究显示，在脑缺血再灌注过程中蛋白酶体的活性显著下降〔4〕，这被认为是导致脑缺血再灌注后神经元内形成蛋白聚集物的重要病理基础之一〔5〕。因此本研究中，采用大鼠全脑缺血模型，探讨了缺血后处理对海马CA1区神经元内蛋白酶体的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性Wistar大鼠，280～320 g，80只，吉林大学实验动物部提供。分为脑缺血组，后处理组;每组又分为假手术组，12 h恢复组，24 h恢复组，48 h恢复组及72 h恢复组。每组8只，其中4只用于蛋白印迹分析，4只用于苏木素-伊红(HE)染色。

1.2 实验试剂及设备 抗热休克蛋白(hsp)70及hsp40多克隆抗体(美国Cell signaling公司)。蛋白质浓度测定试剂盒(美国Bio-rad公司)。增强化学发光(ECL)试剂(美国Amersham公司)，其他试剂均购自美国Sigma公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司)，胶片(美国Kodak公司)。电泳槽及电泳仪购自美国Bio-Rad公司。激光扫描共聚焦显微镜为德国产Zeiss LSM 510型;震动切片机为德国产Leica VT-1000S型。

1.3 方法

1.3.1 全脑缺血模型的制作 全脑缺血模型的制作采用双侧颈总动脉暂时夹闭法。动物禁食12 h，随意饮水。先以5%(30%O2，70%N2O)氟烷诱导麻醉，然后以2%浓度维持麻醉。尾动脉插管监测动脉血压，同时注射0.05 ml(150 IU/kg)肝素。右侧股动脉插管备用。颈部正中直切口，分离双侧颈总动脉。颞肌下和直肠内分别插入热敏探头，监测头温和体温;手术过程中用恒温毯将头温和体温保持在36.8℃ ～37.2℃。缺血时先用动脉瘤夹夹闭双侧颈总动脉，经股动脉抽血将动脉压降至50 mmHg后再进行缺血，缺血时间为15 min。缺血结束后，除去动脉瘤夹并将血液回输。

1.3.2 缺血后处理方法 脑缺血结束后，松开动脉瘤夹恢复脑供血30 s，再夹闭双侧颈总动脉阻断脑供血30 s;如此反复，3个循环后完全解除颈动脉夹闭，彻底恢复脑供血。见图1。

1.3.3 脑组织固定 将大鼠麻醉、气管插管后连接呼吸机，以3%的氟烷维持麻醉，打开胸腔，暴露心脏，左心室内注射0.1 ml(300 IU/kg)肝素后，将导管经左心室插入主动脉，先以4℃的PBS液冲洗3 min，然后用4℃含有4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(PBS)液灌注3 min，取出脑组织，放于含有4%多聚甲醛的PBS液中固定24 h(4℃)。

1.3.4 HE染色 将载有脑片的载玻片放置于背光处阴干，用梯度乙醇溶液脱水后置于HE溶液中15 s，冲洗干净后，放入Scott溶液中10 s，冲洗后放入HE溶液中10 s，再经乙醇溶液脱水后进行透明处理，加盖玻片。在高倍显微镜下选择海马CA1区进行观察，同时对存活的神经元进行计数。

1.3.5 胞浆蛋白组分的分离 大鼠麻醉后，迅速断头，分离海马CA1区脑组织用液氮冷冻保存。将脑组织称重后，按照重量体积比1:10加入匀浆缓冲液，匀浆器抽压35次。匀浆组织液以4℃ 6 500 r/min离心20min，抽取上清用于分离胞浆蛋白组分(分离条件为4℃ 75 000 r/min离心1 h，上清即为含有胞浆蛋白的组分)。Bradford法测定含有胞浆蛋白组分的蛋白浓度后，保存于－20℃冰箱备用。

1.3.6 蛋白印迹分析 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳。0.45μm PVDF膜湿法电转膜。室温下3%胎牛血清(BSA)封闭1 h。置于摇床上与抗蛋白酶体anti-20Sα-1(1∶1 000)，anti-19SS12(1∶1000)在 4℃下孵育过夜。室温下与二抗孵育1 h。再与ECL一起孵育1 min，然后经过曝光，显影，冲洗，定影等步骤。将冲洗后的胶片扫描到电脑中，用Kodak 1D软件测定每一个条带的灰度值。

1.3.7 蛋白酶体活性检测 将10μl(1μg/μl)新鲜制备的海马CA1区匀浆混合物至于96孔板内，在37°C与10μl的succinyl-LLVY-AMC(300μmol/L)以及 85μl的分析缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，and 20%glycerol)共同孵育30 min，分光光度计检测结果。

1.4 统计学方法 应用STATA2.0统计软件进行分析，所有数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 缺血后处理具有保护短暂脑缺血后神经元延迟性死亡的作用 HE染色显示缺血再灌注后72h，海马CA1区神经元几乎全部死亡，死亡的神经元胞浆粉染，胞核固缩深染，呈现多角形。然而缺血后处理组则有部分神经元存活。统计发现，缺血组仅有5.21%±1.21%的神经元存活;而后处理组存活的神经元则高达55.32%±5.34%，二者之间具有显著性差异(P＜0.01)。这提示，缺血后处理对脑缺血后海马CA1区神经元具有保护作用。

2.2 缺血后处理能够显著改善海马CA1区神经元内蛋白酶体的活性 蛋白酶体活性检查结果显示，同假手术组相比较，在脑缺血再灌注后12 h，24 h和48 h海马CA1区内蛋白酶体的活性分别降低到45.32% ±4.13%，47.41% ±3.83%和43.52%±4.22%。然而，缺血后处理使海马CA1区神经元内的蛋白酶体活性分别提高到73.63% ±6.61%，79.23% ±7.14%和77.63%±5.92%。

2.3 缺血后处理能够显著提高海马CA1区神经元蛋白酶体的表达 蛋白印迹分析显示，在缺血组中海马CA1区神经元内蛋白酶体20Sα-1和19SS12亚基的表达在再灌注后12 h，24 h和48 h呈显著降低;但是，缺血后处理能够改善了海马CA1区神经元内20Sα-1和19SS12亚基的表达。统计分析显示，二组之间具有显著性差异。

3 讨论

对于蛋白聚集物形成的机制，目前较普遍的观点是，细胞受到应激刺激后，一方面细胞内新合成的蛋白质会产生错误折叠(misfolded);另一方面，细胞内的蛋白质会发生解链(unfolded)而变性〔6，7〕。这两类异常蛋白质都不具有正常的空间结构，使本应该位于蛋白质内部的疏水集团暴露在外面，这些具有黏性的疏水基团彼此粘连在一起形成细胞毒作用的蛋白聚集物〔8〕。蛋白聚集物可以沉积在胞浆中，也可以黏附在线粒体和高尔基体等膜性细胞器上，影响细胞的正常生命活动，最终导致细胞的死亡〔9〕。

细胞内每时每刻都有错误折叠蛋白及解链蛋白生成，但细胞内并不形成蛋白聚集物，这是因为细胞内存在蛋白质量控制(Protein quality control)系统，能够监控细胞内形成的异常蛋白，并及时地将其清除掉〔10〕。蛋白酶体是真核细胞内存在的选择性降解损伤蛋白、错误折叠蛋白及解链蛋白的降解途径，是细胞内蛋白质质量监控系统的重要组成部分。以往研究表明，全脑缺血再灌注后，蛋白酶体活性显著下降，这被认为是导致细胞内需要降解的蛋白不能被及时分解，进而这些不具有正常结构的蛋白质彼此粘连在一起形成具有细胞毒作用的蛋白聚集物〔11〕。而且，这些暴露了黏性疏水末端的异常蛋白还可以粘连到细胞内的膜性结构上，导致细胞内的膜性结构功能障碍，不能执行正常的生物功能。因此，改善蛋白酶体的活性能够促进细胞内异常蛋白的降解，减少细胞内的蛋白聚集物的形成。但是，目前尚缺乏有细胞的途径提高脑缺血蛋白酶体的活性。

本研究进一步证实了蛋白酶体活性下降与脑缺血再灌注后神经元死亡有密切关系，还为缺血后处理的脑保护作用提供了一个新的途径。

1 Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy:ischemic postconditioning reduces infarctsize after focal ischemia in rats〔J〕.JCereb Blood Flow Metab，2006;26(9):1114-21.

2 Zhou C，Tu J，Zhang Q，et al.Delayed ischemic postconditioning protects hippocampal CA1 neurons by preservingmitochondrial integrity via Akt/GSK3β signaling〔J〕.Neurochem Int，2011;59(6):749-58.

3 ZhangW，Miao Y，Zhou S，et al.Neuroprotective effects of ischemic postconditioning on global brain ischemia in rats through upregulation of hippocampal glutamine synthetase〔J〕.J Clin Neurosci，2011;18(5):685-9.

4 Ge P，Luo Y，Wang H，et al.Anti-protein aggregation is a potential target for preventing delayed neuronal death after transient ischemia〔J〕.Med Hypotheses，2009;73(6):994-5.

5 Ohtsuka K，Hata M.Molecular chaperone function ofmammalian Hsp70 and Hsp40-a review〔J〕.Int JHyperthermia，2000;16(3):231-45.

6 Schroder M.The unfolded protein response〔J〕.Mol Biotechnol，2006;34(2):279-90.

7 Marciniak SJ，Ron D.Endoplasmic reticulum stress signaling in disease〔J〕.Physiol Rev，2006;86(4):1133-49.

8 StefaniM，Dobson CM.Protein aggregation and aggregate toxicity:new insights into protein folding，misfolding diseases and biological evolution〔J〕.JMol Med，2003;81(11):678-99.

9 Grune T，Jung T，Merker K.Decreased proteolysis caused by protein aggregates，inclusion bodies，plaques，lipofuscin，ceroid and aggresomes during oxidative stress，aging and disease〔J〕.Inter J Biochem Cell Biol，2004;36(12):2519-30.

10 Nishikawa S，Brodsky JL，Nakatsukasa K.Roles ofmolecular chaperones in endoplasmic reticulum(ER)quality control and ER-associated degradation(ERAD)〔J〕.JBiochem(Tokyo)，2005;137(5):551-5.

11 Ge P，Luo Y，Liu C，et al.Protein aggregation and proteasome dysfunction after brain ischemia〔J〕.Stroke，2007;38(13):3230-6.

R749

A

1005-9202(2013)05-1064-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.036

国家自然科学基金资助项(No.30973110);吉林省科技厅(No.200805122)

罗毅男(1951-)，男，教授，主任医师，博士生导师，主要从事缺血性脑损伤及脑肿瘤的临床研究。

杨 颖(1984-)，女，在读硕士，主要从事缺血性脑损伤的临床研究。

〔2012-11-12收稿 2013-01-10修回〕

(编辑 袁左鸣)