虫草液体培养的研究进展

林群英，吴亮亮，张锋伦，孙晓明

(南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京210042)

虫草(Cordyceps)液体培养最早可追溯到1951年，仅比深层发酵应用于大型食用真菌晚4 年［1］。液体发酵具有快速、高效且简便的优点，是开发虫草的一种重要途径，同时，也是虫草子实体栽培最常用的生产菌种制作方式。目前，不少虫草如蛹虫草(C. militaris)和古尼虫草(C. gunnii)等已经成功进行大规模的发酵培养，蛹虫草已达吨级生产规模［2］。一些新发现或生长要求严格的虫草种类还处于试验阶段，如冬虫夏草(C. sinensis)、江西虫草(C. jiangxiensi)和粉被虫草(C. pruinosa)。发酵产物主要有菌丝体和多糖、虫草素、腺苷和虫草酸等活性物质。以下主要对影响虫草液体培养的营养因素和环境条件两方面的研究进展进行综述。

1 营养因素对虫草液体培养的影响

1.1 碳源

虫草多以结构简单的单糖和双糖为生长的最佳碳源。蛹虫草菌丝体在含有葡萄糖或蔗糖的培养基内生长最好［3-4］。而陈晋安等人认为蛹虫草的菌丝生长以蔗糖为最佳碳源，效果远优于葡萄糖［5］。亦有研究显示甘露醇、淀粉和半乳糖最利于蛹虫草菌丝体的生长［6-7］。这可能是由于菌株或其他营养因素的差异而引起的。而蛹虫草胞外多糖形成的最佳碳源为蔗糖［7］。除菌丝体和胞外多糖外，蛹虫草还可利用马铃薯淀粉产生最大量的过氧化物酶［8］，能利用葡萄糖产生最大量的虫草素，产量与葡萄糖的用量无相关性［9］。诱变育种可改变菌株对碳源的要求。经离子束诱变育种获得的菌株G81 -3 所需的葡萄糖浓度远远高于出发菌株，虫草素的浓度可达6.84 g/L，远高于出发菌株［10］，同时，葡萄糖是蛹虫草液体菌种生产的最佳碳源好［11］。

其它虫草对碳源的利用情况与蛹虫草相似，以单糖或双糖为生长的最佳碳源，但在碳源的种类方面表现出各自的营养差异。单侧虫草(C. unilateralis)菌丝生长以葡萄糖为最佳，但几乎完全无法利用蔗糖［12］。冬虫夏草、江西虫草和大团囊虫草(C.ophioglossoides)L2 菌丝生长以蔗糖为最佳［13-15］，辛克莱拟青霉(P. sinclairii)、辛克莱虫草(C. sinclairii)无性型)以蔗糖为菌丝生长和胞外多糖形成的最佳碳源［16］。蜂头虫草(C. sphecocephalla)和细脚拟青霉(P. tenuipes，高雄山虫草(C. takaomontana)无性型)C240 分别利用蔗糖和葡萄糖形成的胞外多糖得率最高［16-17］。虫草菌丝生长或次生代谢物形成的最佳碳源还有麦芽糖、甘露糖、马铃薯淀粉和甘露醇等［18-21］。

不同种类或同一种类不同菌株的虫草对碳源表现出一定的差异，因而在进行大规模生产前必须先进行碳源筛选以获得最佳的培养效果。

1.2 氮源

氮源是影响虫草液体培养的另一重要营养成分，甚至可起到碳源的作用。氮源可分为有机氮和无机氮，有机氮包括动物性氮源、植物性氮源和微生物氮源。多数情况下，有氮源比无机氮更利于虫草的培养。

与碳源的利用情况相似，蛹虫草的不同菌株对氮源表现出较大的差异。有报道认为酵母浸膏比蛋白胨更利于蛹虫草菌丝的生长［5-6，22］。Wang 等人(2006)则认为蛹虫草对酵母浸膏和胰蛋白胨的利用情况无差别，均可达到最大生物量。玉米粉是蛹虫草菌株NG1、NG3 菌丝生长和胞外多糖形成的最佳氮源［4，23］;玉米粉和蛋白胨分别是菌株C738 菌丝生长和胞外多糖形成的最佳氮源［24］。蛋白胨亦是制作蛹虫草液体菌种最佳的氮源［25］。蛹虫草对氮源的用量有一定的要求，当酵母浸膏的用量超过最佳值后，用量越大，蛹虫草菌丝体的产量反而越低［26］。以上所有研究均显示，有机氮比无机氮更利于蛹虫草菌丝的生长和胞外多糖的形成。

其它虫草种类对氮源的利用情况与蛹虫草相似，多能利用蛋白胨和酵母浸膏。细脚拟青霉C240的菌丝生长以胰蛋白胨为最佳氮源［18］。冬虫夏草和蜂头虫草的菌丝利用蛋白胨生长最快，蜂头虫草利用酵母浸膏形成的胞外多糖产量最高［13，17］。江西虫草利用酵母浸膏达最大生物量和多糖产量［14］，单侧虫草亦如此，而几乎无法利用蛋白胨、酪蛋白和乳白蛋白［12，19］。大团囊虫草利用经水解的蚕蛹和酵母浸膏作为最佳的菌丝生长氮源［15］。粉被虫草利用牛肉浸膏使菌丝生长最快［27］。在静置培养时，古尼虫草利用尿素生长最快［20］。辛克莱拟青霉利用玉米粉作为氮源能达最大菌丝生长速度和多糖产量［16］。

部分种类能利用无机氮进行生长，单侧虫草以硫酸铵为唯一氮源时，能产生最大量的具抗疟疾活性的萘醌类物质;细脚拟青霉以硝酸钾为多糖形成的最佳氮源［18］。蛹虫草利用硝酸盐和铵盐仅能产生不足5.5 g/L 的菌丝体和0.57 g/L 胞外多糖，以氯化铵为氮源时，仅能生成1.75 g/L 菌丝体［4，7］。多数情况下，与有机氮培养的菌丝体产量(15 g/L ～20 g/L)相比，无机氮极不利于虫草菌丝培养。

1.3 碳氮比

碳氮比是指培养基中碳元素总分子量与氮元素总分子量的比值。实际应用中，有不少研究是按质量计算碳氮比的。合适的碳氮比(10∶1 ～20∶1，分子量比)可促使虫草菌丝的生长，最大限度地提高培养基原料的利用率。冬虫夏草菌丝在碳氮比为12∶1(分子量比)时生长最好［13］。碳氮比为20∶1和12∶1(分子量比)，辛克莱拟青霉菌丝体和多糖的产量最高，分别为30 g/L 和2.9 g/L［16］。碳氮比为20∶1(分子量比)时，蛹虫草菌丝体产量最高，达27 g/L，多糖为6.99 g/L，过低的碳氮比会抑制菌丝的生长，导致菌丝得率下降。碳氮比为2∶1(质量比)时，蛹虫草生产的虫草素产量最高，可达345.4 mg/g［7，9］，菌丝生长最快［28］。

1.4 其他营养成分

除碳源和氮源外，无机盐和维生素也是虫草液体培养基的重要组成部分。无机盐包括大量元素和微量元素，这些元素能促进菌丝生长，或能提高胞外多糖等有效成分的产量。由于培养基中使用的碳源和氮源，尤其是氮源多为抽提物，含有较多其他物质，其中亦包括无机盐，所以，已有的研究结果只在一定程度上说明其生理作用。尽管如此，无机盐的研究仍是发酵培养基优化的重要内容。钙、镁、钾和钠等大量元素对冬虫夏草菌丝生长无明显的作用，微量元素铜、铁、锰和锌有一定的促进作用［13］。K2HPO4和KH2PO4分别对细脚拟青霉的菌丝生长和多糖形成有促进作用［18］。FeSO4和KH2PO4对蛹虫草的生长有轻微的抑制作用［4］，但FeSO4对虫草素有显著的促进作用［29］。Ca2+，Co2+，Fe2+，K+和Mn2+对辛克莱拟青霉有促进作用［16］。

酵母浸膏不仅作为氮源，还是重要的维生素来源，基本可以满足虫草生长的要求，然而，维生素对虫草生长影响的系统研究报道却十分少见。董彩虹和姚一建详细研究了维生素对冬虫夏草生长的影响，发现仅叶酸有明显的促进作用［13］。

除以上各种常见的营养元素外，一些独特的物质对虫草生长的影响也有报道。植物油和真菌激发子分别对蛹虫草菌丝的生长和虫草素的产量有刺激作用［26，30］。

2 环境条件对虫草液体培养的影响

2.1 温度

大多数情况下，培养温度为20 ℃～25 ℃时虫草的菌丝生长最快，在稍高温度(25 ℃～30 ℃)下产生较多的胞外多糖。蛹虫草菌株的最适生长温度范围在20 ℃～25 ℃，最适值因不同菌株而有所不同;在25 ℃～30 ℃时，菌丝生长虽受到一定抑制，但胞外多糖的产量却得到很大的提高［4-5，23，31］。与蛹虫草相似，江西虫草和辛克莱拟青霉在25 ℃下达最高生物量，而在28 ℃和30 ℃下，分别生产出最高产量的多糖［14，16］。25 ℃下，古尼虫草、分离自泰国的单侧虫草和分离自韩国的蜂头虫草达最快生长速度［17，32-33］。细脚拟青霉C240 的生长温度比一般种类高，28 ℃时，菌丝生长最快，胞外多糖产量最高［18］。冬虫夏草最为特别，最佳生长温度范围为18 ℃～20 ℃，且对温度的改变极为敏感，25 ℃以上则严重抑制生长，是一种少见的嗜低温虫草种类。目前，还未发现最适生长温度高于30 ℃的虫草种类或菌株。

2.2 pH 值

pH 值是对菌丝生理、生长有重要作用的因素。酸性至中性的温和条件适合虫草菌丝生长，而胞外多糖的形成则以中性至弱碱性为好，或略高于菌丝生长的最佳pH。

弱酸性至中性范围(pH 6.0 ～pH 7.0)是古尼虫草、细脚拟青霉、辛克莱拟青霉、蝉拟青霉C240、巴西虫草(C. brasiliensis)等菌丝生长和胞外多糖形成的最佳pH 条件［16，18，33-34］。Xu 等人再次对细脚拟青霉C240 菌株进行研究后，认为pH 4.88 和pH 4.00 是菌丝生长和多糖形成的最佳pH，但文中并未对这与2003 年报道的明显不同的结果进行比较或分析原因［35］。有些种类选择更酸的生长环境，如蜂头虫草在pH 5 和pH 4 下，菌丝生长最快，形成的多糖最多［17］。蛹虫草的不同菌株对pH 的要求各有不同，菌株NG3 分别在pH4 和pH8 下，菌株C738分别在pH 9 和pH 6 下，菌丝生长最快，胞外多糖产量最高［23-24］。有研究则认为蛹虫草菌丝体生长以酸性至中性(pH 5 ～pH 7)为最佳生长条件，多糖的生产则以偏碱性的条件为宜［7，36］。日本拟青霉(P.japonica，日本虫草(C. japonica)无性型)在pH 8 的碱性条件达最佳生长状态，菌丝体和胞外多分子聚合体分别为14 g/L 和34.5 g/L［35］。

2.3 通气状况

在液体培养时，虫草需要在一定的通气条件下才能良好生长。在以三角瓶振荡培养时，振荡速度一般为120 r/min ～150 r/min。振荡速度为150 r/min ～200 r/min 时，粉被虫草和古尼虫草的菌丝体最高产率分别可达29.97 g/L 和12.18 g/L［27，33］。蜂头虫草在搅拌速度300 r/min 时，菌丝体产量最高，达28.2 g/L;150 r/min 时，胞外多糖产量最高，达2.5 g/L，与日本拟青霉情况相似［17，37］。虫草素形成的通气要求要比菌丝生长低。在经优化培养基内，通过静置表面培养蛹虫草，虫草素由原来的550 mg/L 提高到640 mg/L，最大的生产能力为32 mg/(L·d)［38］。

3 展 望

虫草液体培养研究包括碳源、氮源、碳氮比及其他营养成分等营养因素和温度、pH 和通气等环境条件对菌丝生长和活性成分产量的影响取得了令人振奋的成果。为更好地利用应用虫草液体培养技术，应加强以下两方面的研究。

3.1 生物合成活性成分

虫草是一类药用价值极高的大型真菌，含有丰富多样的生理活性成分。虫草素是被研究最多的活性物质，其产量已经通过诱变育种和优化培养条件得到大幅度的提高［39］。而其它活性成分仍有待深入的研究，才能更好地实现虫草资源的开发利用。结合新发展的发酵技术如高密度发酵等，加强虫草资源的开发利用，满足市场对虫草产品的需求。

3.2 液体生产种质量

虫草液体培养的产量除了直接用于深加工外，作为生产种用于子实体栽培的系统研究较少报道。生产种的质量可直接影响出草情况，因此，有必要加强在这方面的研究。除了营养要求外，其它因素对液体菌种质量的影响仍有待进一步研究。

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