靶向c-FLIP在癌症治疗中的分子调节机制①

王琪琳 (聊城大学生命科学学院，聊城 252059)

凋亡对于维持组织的自稳态和正常发育非常重要。与凋亡相关的信号通路主要有两个:一个是配体结合诱导的外部凋亡通路，另一个是线粒体依赖的内部凋亡通路。c-FLIP是外部凋亡通路中的一个重要负调控因子，它的13个剪切突变体基因已经被鉴定，但是只有三个能翻译成蛋白质(c-FLIPL、c-FLIPS和c-FLIPR)。c-FLIPL是一个55 kD的蛋白质，结构类似于Caspase-8前体，氨基端有两个DED结构域，羧基端有一个Caspase结构域。但由于c-FLIPL的羧基端结构域缺乏半胱氨酸(Cys)，因此缺乏酶的活性。c-FLIPS和c-FLIPR在氨基端也含有两个DED结构域，但是其羧基末端都比c-FLIPL羧基末端短。在c-FLIPS和c-FLIPR中，两个DED结构域被一串氨基酸连接，在蛋白质的泛素化和降解方面可能具有重要作用［1］。c-FLIP的表达可以在转录水平和翻译后水平进行调节，并受磷酸化和泛素化的影响。在许多肿瘤细胞中，c-FLIP表达较高，用c-FLIP抑制剂与TRAIL或者与传统化疗联合处理，可使c-FLIP表达下调，进而诱导细胞凋亡。因此c-FLIP在癌症治疗中可作为一个重要的分子靶标。

1 c-FLIP

1．1 肿瘤细胞中c-FLIP的过表达 c-FLIP在一系列癌症，如结肠癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌中表达较高。在大多数情况下，c-FLIPL在恶性肿瘤中表达增加;另有研究表明c-FLIPS表达也上调，如在胃癌SNU-216细胞和胰腺癌中c-FLIPS表达上调［2］。c-FLIP的过表达可增加拮抗 Fas、TRAIL介导的细胞凋亡。研究证实，在某些组织中c-FLIP的高表达水平还与肿瘤的迁徙有关。在结肠癌、宫颈癌、伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和膀胱癌中，c-FLIP的表达水平升高与不良预后有关［3，4］。c-FLIP 异构体在肿瘤细胞中过表达，其表达水平不仅与死亡受体靶向的治疗有关，还与传统治疗有关，因为c-FLIP抑制抗癌药物诱导的细胞凋亡。

1．2 c-FLIP的作用 在外部凋亡通路中，c-FLIP募集到DISC中可以抑制Caspase-8前体的二聚化和活性，从而抑制凋亡事件的发生。c-FLIPL与Caspase-8前体可以形成一个异源二聚体，c-FLIPL与Caspase-8前体的异源二聚化，可以诱导Caspase-8的活性［5］。复合体中Caspase-8的有限激活可以产生p43-c-FLIP和p41/p43-Caspase-8亚单元，然而由于c-FLIPL缺乏蛋白酶水解活性，进一步的切割不能发生，切割的产物继续与DISC结合，阻止凋亡信号的进一步转导。尽管如此，活化的Caspase-8能够接近部分底物，如RIP。RIP在细胞膜上不同的切割，可以导致由Fas配体激活c-FLIPL和c-FLIPS对下游信号通路中 c-Fos或者 NF-κB的不同调节［6］。

2 c-FLIP的转录表达调节

越来越多的转录调节因子被发现结合在c-FLIP的启动子上，转录调节因子对c-FLIP异构体的不同调节，可能是以一种细胞依赖的方式，在特定刺激条件下决定细胞的命运。

实验证明，调控c-FLIP的转录因子有NF-κB、p53、p63、FOXO3a、EGR1、AR、Sp1、E2F1、c-Myc、IRF5、c-Fos、NFATc2 和 hnRNPk［7-12］。NF-κB、p53、p63、NFAT、EGR1、hnRNPK、AR 和 Sp1 诱导 c-FLIP的表达;而 c-Myc、FOXO3a、c-Fos、IRF5 和 Sp3 抑制c-FLIP的转录。许多信号通路通过激活这些转录因子来调控c-FLIP，其中涉及到TNF配体、生长因子、白介素、趋化因子、DNA损伤试剂或者非传统的化疗试剂。TNF-α和 CD40配体可激活 NF-κB，导致c-FLIP表达上调从而抑制Fas、TNFR1和TRAIL受体介导的细胞凋亡［13］。另外 PI3K、Akt、MAPK信号通路的激活或者生长因子刺激，也可以诱导c-FLIP的转录水平上调。趋化因子IL-8在前列腺癌细胞系中，通过激活NF-κB和雄性激素依赖的转录方式而增加 c-FLIPS和 c-FLIPL的 mRNA水平［14］。干扰素-β介导的IRF5(Interferon regulatory factor 5)的激活与PMA或者TRAIL诱导的c-Fos的激活可抑制 c-FLIP 的表达［15］。

c-FLIP异构体的调节机制现在还不完全清楚，可能依赖于转录因子或者激活的信号通路，还可能依赖于特定的细胞系。在肺癌中，E2F1可抑制c-FLIPS而不是c-FLIPL的表达［2］;在活性T-细胞中c-FLIPS的表达上调特别依赖于 NFATc2［11］;CD40介导的c-FLIPR的表达上调可抑制Fas诱导的细胞凋亡。尽管c-FLIPL和c-FLIPS都受NF-κB调节，但在红白血病细胞系TF-1中，c-FLIPR的表达是以不依赖于 NF-κB 的方式被 TNF 激活所诱导［16］。在HaCat细胞系中用RNAi筛选p63靶标发现，同一种转录因子对不同c-FLIP异构体的调节可能不同。p63可能专门诱导c-FLIPR的表达，而抑制c-FLIPR并不影响c-FLIPL表达水平［7］。因此，有必要在不同细胞中研究c-FLIP异构体的表达调控机制。

2．1 PKCε/NF-κB 信号通路对 c-FLIP 的调节NF-κB是真核细胞的转录因子，几乎存在于所有的细胞中。在有害刺激(如病毒、脂多糖、佛波酯及dsRNA)等作用下，PKCε活化并激活NF-κB转位到细胞核，与多种细胞因子、应激相关等基因启动子和增强子上的κB序列特异结合，促进细胞因子的过表达和细胞在应激条件下的存活和生长。研究发现［17］，PKCε 的活化可以增强 c-FLIP mRNA 的转录，诱导c-FLIP表达上调;而NF-κB活性的抑制则能抑制PKCε诱导的c-FLIP的表达上调。人T细胞白血病Ⅰ型病毒癌蛋白tax可以通过激活NF-κB诱导c-FLIP的表达，抑制Fas介导的细胞凋亡［18］。NF-κB抑制剂 DHMEQ可抑制 CLL细胞内 NF-κB的活性诱导细胞凋亡，并伴随NF-κB依赖的抗凋亡基因，如c-IAP、Bfl-1、Bcl-xL和 c-FLIP等基因的表达下调［19］。由此可见在上调 c-FLIP表达的过程中，PKCε/NF-κB 信号通路以及 NF-κB 的活性起了至关重要的作用。

2．2 PI3K/Akt信号通路对c-FLIP的调节 PI3K/Akt信号通路与细胞生长、增殖及癌变密切相关，是细胞内一条重要的信号转导通路。PI3K催化磷脂酰肌醇(PI)磷酸化生成PIP3，在PIP3存在的情况下，磷脂酰肌醇依赖性激酶-1(Phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK-1)能磷酸化Akt/PKB并使之活化。在肿瘤细胞内，PI3K通过Akt的磷酸化可增强c-FLIP mRNA的转录及蛋白质表达水平［20］。PI3K抑制剂下调c-FLIP的表达，增强Fas介导的HL-60细胞凋亡的敏感性。尽管在口腔磷状上皮细胞癌(OSCC)中，PI3K抑制剂Waltman和LY294002不影响OSCC细胞中Fas的表达，却能强烈抑制Akt的磷酸化、显著降低细胞内c-FLIP的水平，促进Fas介导的细胞凋亡［20］。c-Myc作为一个癌基因，在细胞增殖和细胞凋亡中具有双重作用。PI3K/Akt信号通路的激活可诱导c-Myc的转录，而c-Myc表达增加可使c-FLIP表达降低，促进TRAIL诱导的细胞凋亡［21，22］。染色质免疫沉淀及荧光标记分析显示，c-Myc结合并抑制了c-FLIP的启动子，c-Myc的表达增强了TRAIL诱导的DISC中Caspase-8的活性，从而促进了c-FLIP的降解。在对TRAIL敏感的细胞系中，c-Myc的表达水平与细胞对TRAIL的敏感性呈正相关。过表达c-Myc或激活融合的Myc-ER(雌激素受体)，可增加TRAIL耐受细胞对TRAIL敏感性;如果用siRNA抑制c-Myc活性，能显著降低c-Myc的表达和TRAIL诱导的细胞凋亡。c-FLIP是c-Myc的直接靶向作用蛋白，无论是在培养细胞还是在c-Myc诱导肿瘤发生的小鼠动物模型中，过表达c-Myc或者活化Myc-ER都能降低c-FLIP的表达水平，而用siRNA抑制c-Myc的活性则能增强c-FLIP的表达［21］。另外，补体C5b-9复合物可以抑制凋亡蛋白Caspase-8的活化以及对Bid的切割，显著提高c-FLIPL蛋白的表达水平。但是，PI3K抑制剂LY294002可逆转C5b-9复合物的抗凋亡效应［23］。综上所述，PI3K/Akt信号通路对 c-FLIP的表达调控具有很重要的作用。

2．3 转录因子E2F1对c-FLIP的调节 转录因子E2F1是在细胞周期S期及细胞凋亡过程中起作用的转录因子。研究发现［24］，低水平表达E2F1的肺癌细胞中，c-FLIPs特异性过表达;在不同的肺癌细胞系中，E2F1可以通过下调c-FLIPS并激活死亡诱导信号复合体DISC中Caspase-8，诱导细胞凋亡。E2F1可促进Fas和TRAIL介导的肿瘤细胞凋亡，增强T淋巴细胞抗肿瘤的细胞毒效应。在原发性肺癌细胞中低水平的E2F1可能是促成细胞癌变的一个重要因素，其表达水平的下调将促成肿瘤细胞的免疫逃逸。因此，在死亡受体介导的细胞凋亡通路中，E2F1是一个至关重要的细胞凋亡转录调节因子。

2．4 其他 干细胞因子(SCF)可增强 c-FLIP mRNA的转录及蛋白质表达，减弱IFN-γ诱导的细胞凋亡。研究认为［25］，雄激素可以提供前列腺上皮细胞生存信号，前列腺中雄激素的去除会诱导细胞凋亡。在雄激素存在的情况下，雄激素受体被募集到c-FLIP基因的启动子上，诱导c-FLIP基因的表达，研究表明在雄激素作用下，雄激素受体可以通过调节c-FLIP基因影响前列腺细胞的存活和凋亡。TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的敏感性，除了与c-Myc和MEK/Erk诱导的Caspases活性增强之外，发现Akt-mTOR途径也调控TRAIL介导的细胞凋亡，该途径不是增强细胞对TRAIL的敏感性及Akt的表达，而是通过mTOR及其靶蛋白S6激酶和eIF-4E起作用，选择性地增强抗凋亡蛋白c-FLIPS的翻译，阻抑TRAIL介导的细胞凋亡［26］。

3 c-FLIP的翻译后表达调节

除了转录水平的调节外，c-FLIP的异构体在转录后水平还特别受到一些化合物的调节。这些化合物可以诱导c-FLIP的降解，增加死亡受体介导的细胞凋亡的敏感性。c-FLIP异构体是半衰期比较短的蛋白质，蛋白质或RNA合成抑制剂可降低它们的表达水平［27］。c-FLIP异构体的表达还受热激效应、E3泛素连接酶Itch激活的JNK通路以及泛素蛋白酶体途径所调节，这些调节是磷酸化依赖的或者非依赖的方式。

c-FLIP通过蛋白酶体降解途径比较复杂，可能因为c-FLIP异构体不同的调节机制以及c-FLIP异构体不同的转录后修饰。c-FLIPS对泛素化降解更敏感，可能由于其独特的 C-末端尾巴［28］。E3-泛素连接酶Itch是由JNK调控的，它可以使c-FLIP结合上泛素化链而通过蛋白酶体途径进行降解［1］。在FasL介导的细胞凋亡过程中，ROS也是通过蛋白酶体诱导c-FLIP下调［29］。NF-κB可通过抑制细胞中的ROS水平而抑制JNK活性，导致Itch连接酶活性的降低，从而稳定细胞中c-FLIP的表达水平。c-FLIPL能被Itch泛素化，但c-FLIPL的泛素化并不需要CUL3，它也是一个E3连接酶，可以介导Caspase-8的泛素化。现已证明Itch是c-FLIPS的泛素化的关键调节者。c-FLIPL和c-FLIPS也可以不依赖于JNK 的方式进行降解［30］。

c-FLIP的蛋白水平也受磷酸化的重要调节。c-FLIPS的Ser193磷酸化可以抑制它的泛素化，从而稳定c-FLIPS在细胞中的表达水平而促进细胞的存活［31］。c-FLIPL的Ser273可以被Akt以一种JNK和Itch依赖的方式磷酸化，这对于降低c-FLIP的水平是非常重要的［32］。相反，Akt能促进E3连接酶Itch的多泛素化和降解，从而稳定 c-FLIPs的表达［33］。在老鼠巨噬细胞中，蛋白激酶p38和c-Cbl可以使c-FLIPs特定氨基酸残基磷酸化，促进 c-FLIPs和 E3连接酶 c-Cbl之间的相互作用［34］。

4 靶向c-FLIP的癌症治疗

c-FLIP的过表达可拮抗FasL和TRAIL诱导的细胞凋亡，而抑制c-FLIP可以克服这种抗性。因此靶向c-FLIP，特别是与TRAIL或者传统化疗联合处理，可能是癌症治疗的有效方法。

新陈代谢抑制剂，如蛋白质合成抑制剂cycloheximide、anisomycin和RNA合成抑制剂actinomycin D最初用来研究抑制c-FLIP表达的分子机制［35，36］。研究显示这几种化合物能够下调c-FLIP。用5-FU进行化疗也能够下调结肠癌细胞系中c-FLIPS和c-FLIPL的表达水平［37］。

蛋白酶体抑制剂在许多不同的细胞系中被广泛研究，作用效果依赖于所研究的细胞系。在不同肿瘤细胞中，用Bortezomib或者小分子蛋白酶体抑制剂MG132处理之后可以增加或者降低c-FLIP的表达水平［38-44］，但 Bortezomib和 MG132都可以增加TRAIL诱导的细胞凋亡敏感性。

DNA损伤试剂可以降低肿瘤细胞中c-FLIP的表达水平，然而这种表达水平在不同类型的细胞中是不同的。一些化疗药物可使c-FLIP表达水平升高，相反另外一些化疗试剂可以降低c-FLIP表达水平。在卵巢癌细胞系中，Cisplatin可以使c-FLIP以p53依赖的方式进行泛素化降解，主要是与p53、Itch形成一个三元复合体［45］。三元复合体所导致的c-FLIPL/S的泛素化是由Akt信号通路控制的。在p53野生型结肠癌 HCT116细胞中，oxaliplatin和CPT11都可以诱导c-FLIPS/L的表达下调;而在p53突变的 HT29细胞中，oxliplatin和 CPT11诱导 c-FLIP表达下调，并且药物处理之后的细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡更加敏感，表明细胞凋亡与p53的状态没有关系［37］。在黑素瘤中 Cisplatin能下调c-FLIPs的表达，但不是 c-FLIPL;Cisplatin处理后，c-FLIPL脱磷酸化［46］。在胶质瘤中 c-FLIPL被CaMKII磷酸化之后可以促进c-FLIPL的在DISC中的募集而抑制Caspase-8结合，因此推断c-FLIP的脱磷酸化会减弱它的抑制活性而促进细胞凋亡［47］。

组蛋白脱乙酰化酶抑制剂和拓扑异构酶Ⅰ抑制剂是新的癌症治疗药物，能够调节c-FLIP的表达水平。TSA处理可以降低卵巢癌细胞中c-FLIP的mRNA和蛋白质表达水平，但并不影响c-FLIPs的表达水平。EGFR信号通路抑制剂可以阻抑TSA对c-FLIPL的调节。在肝癌细胞系中［48］，ITF2357和丙戊酸可以降低c-FLIP的mRNA和蛋白质水平，但是研究并没有区分不同的异构体［49］。另外，通过RNAi干扰直接抑制 c-FLIP的翻译可能是下调c-FLIP的最专一的方法［50］。但是在这些研究中，损伤或者修饰DNA的试剂靶向c-FLIP可能会有一定困难，因为作用于c-FLIP的效果在细胞类型之间是不同的，可能会影响两种或者一种c-FLIP异构体。尽管在体外研究中，用RNAi干扰直接靶向c-FLIP可以增加细胞对TRATL或者FasL诱导的凋亡更加敏感，然而在体内使用RNAi干扰技术有许多限制，因此在临床上抗用RNAi干扰方法靶向c-FLIP可能还需要一段时间。

5 展望

c-FLIP的选择性抑制剂与一些配体(如TRAIL或者FasL)或传统的化疗药物(如5-FU)联合，可成为一种有效的肿瘤治疗方法。合理的设计或者筛选c-FLIP的有效抑制剂，需要深入理解该种蛋白质的调节机制以及不同异构体的功能。另外，希望能开发一系列新的化合物，这些化合物可能会调节恶性肿瘤中c-FLIP不同异构体的表达水平(通过结构类似物竞争，蛋白酶体降解或者转录因子的调节)，甚至调控它们的比例。专门调节c-FLIP不同异构体的表达可恢复死亡受体介导的细胞凋亡的敏感性，通过调控配体介导的细胞凋亡为癌症治疗提供更有效的方法。

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