刘婧婧 综述 毕明宏 审校
目前,肺癌的发病率和死亡率在全球范围内位居各类恶性肿瘤之首[1],预计到2030年肺癌的归因死亡将占全球所有死亡原因的3.1%,这是一个惊人的数字[2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80%-85%,主要包括腺癌、鳞癌、大细胞癌、腺鳞癌、肉瘤样癌等,其中腺癌较易发生于女性及不吸烟者,近30年来所占比例有明显上升趋势。早期发现肺癌患者并给予及时适当的治疗,可以获得好的治疗效果[3],然而80%以上的患者就诊时已失去手术根治的最佳时机,目前第三代含铂两药方案联合化疗是晚期NSCLC的标准一线治疗方案,但其疗效似乎已达平台:有效率仅为25%-35%、中位生存期为8个月-10个月、1年生存率为30%-40%[4]。
近年来随着肿瘤分子生物学的发展,人们逐渐认识到肺癌的发生、发展和转移是一个多阶段、多步骤、多基因参与调控的复杂的生物学过程。目前,通过寻找在肺癌发生发展过程中起重要作用的靶分子及信号途径,进行肺癌的分子分型及靶向治疗成为肺癌研究领域的热点。分子靶向治疗以其符合生理、低毒和理论上高效的特点,让人们看到了跨越这一平台的希望和曙光,是目前治疗晚期NSCLC最具前景的研究领域。
自2011年底开始陆续有报道RET(rearranged during transfection)融合基因存在于肺癌患者中,并且该基因具有可识别的临床病理特征,RET抑制剂抗肿瘤有效,提示RET融合基因可能是继表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变、KRAS(kirsten-rous avian sarcoma)突变、棘皮动物微管相关蛋白样4-间变淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK)融合基因后又一特异性较高的分子标记物。现将相关研究做一介绍。
1.1 RET原癌基因与疾病 1985年Takahashi与Cooper等[5]在重组DNA的实验中,首次发现RET原癌基因。RET原癌基因定位于10号常染色体长臂(10q11.2),现已确定其DNA全长约8万个核苷酸(60 kb),有21个外显子,至少有4个转录产物,且在不同的组织中含量不同[6,7]。由RET原癌基因编码的RET蛋白是一种受体酪氨酸激酶,为1,114个残基跨膜蛋白,它有着受体酪氨酸激酶的经典结构:一个富含半胱氨酸的钙粘连素样细胞外区,一个跨膜区和一个催化酪氨酸激酶(tyrosine kinase, TK)的细胞内区。受体与配体结合后胞内区的TK磷酸化,激活下游信号转导通路,调节细胞生存并诱导细胞增生[6]。RET基因突变在多方面增强了RET TK信号转导的功能,进一步促使激酶的活化和原癌基因的转化[8]。RET原癌基因能与多种基因发生融合,常以本身断裂再与另一基因接合的方式重组成一个新的基因(融合基因),从而逃脱受体结合配体的调控,进行自我磷酸化、自动传导信号,引发肿瘤生成。
之前的研究提到RET基因突变是甲状腺癌症的诱因,不同形式的染色体异位和插入导致PTC/RET融合基因的形成,被认为是甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)的驱动突变[9]。随着研究的不断深入,已经发现RET基因突变与多种疾病的发生密切相关,包括多发性内分泌腺瘤2型[7]、PTC、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma, MTC)[10]、先天性巨结肠[11]和近期发现的肺腺癌(lung adenocarcinomas, LADCs)[12]等。
1.2 KIF5B(kinesin family member5B)基因 KIF5B基因位于10号常染色体短臂(10p11.22),编码KIF5B蛋白,该蛋白是Kinesin驱动蛋白家族1的成员,含有约350个氨基酸残基,是由单体组成的同四聚体,内有三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)结合位点和微管结合位点,其“头部”具有ATP酶活性,能通过水解ATP获得能量,改变构型,且只能以微管构成的轨道朝一个方向滑行。KIF5B的蛋白结构域—LC-S6在启动基因融合事件中不可或缺,它具有一个蜷曲螺旋结构,可以沿着细胞微管运动,使RET蛋白聚合从而导致自体活化,自发诱导下游磷酸化信号转倒。KIF5B和RET通过臂间倒位后融合形成KIF5B-RET融合基因[13],导致多种肿瘤生成。
1.3 CCDC6(coiled-coil domain-containing protein 6)基因CCDC6基因位于10号常染色体长臂(10q21),编码的卷曲螺旋结构域蛋白6参与形成细胞骨架结构。CCDC6-RET基因常见于甲状腺癌样本中,它的过表达会导致肿瘤的发生,被认为是PTC/RET的典型驱动突变基因[9]。也有报道[14,15]指出CCDC6和RET的融合可能导致LADCs的发病。
1.4 TRIM33(tripartite motif-containing 33)基因 也称RFG7或TIF1,位于1号常染色体短臂(1p13.1),是转录中介因子家族的成员之一,控制参与细胞分化[16]。已有报道[17]证实TRIM33和RET的融合与PTC的致病有关,我们期待能够证实TRIM33-RET基因在NSCLC中也有临床意义。
1.5 NCOA4(nuclear receptor coactivator 4)基因 NCOA4基因位于10号常染色体长臂(10q11.2),在睾丸、肾上腺、甲状腺、胸腺、前列腺等多种组织中广泛表达。近期有报道[18]在NSCLC中发现1例NCOA4-RET阳性患者,提示NCOA4-RET融合基因或许也对NSCLC有临床意义。我们相信随着研究的不断深入,未来会发现更多有意义的新的融合位点。
目前已报道的常用RET融合基因检测方法包括免疫组化(immunohistochemistry, IHC)、荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)等,其中PCR又包括逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)和DNA测序技术。多数学者采用RT-PCR法进行检测,也有采用FISH检测,但目前仍无敏感特异稳定的方法用于该分子的检测。研究证明FISH与RT-PCR的检测结果一致,但与IHC的匹配欠佳[19]。这提示前二者可能是检测RET基因状态的最佳选择,且各有优势。我国陈海泉教授及其团队通过不断摸索,创造发明了一种高效、准确、低廉的检测方法——“基于表达不平衡的RET融合基因检测”。目前,这种检测方法及其主要技术要素已申请国家发明专利,有望得到进一步推广和应用。
我国研究者对中国LADCs人群进行基因突变筛查的结果显示:EGFR突变率为66.3%,KRAS突变为2.3%[20]。国外研究[21]提示LADCs中EGFR基因突变率为15%,KRAS基因突变率约为25%,EML4-ALK融合基因突变率约为5%,其他约15%,至今仍有约40%的基因突变尚不明确。2011年12月,韩国Ju等[22]在1例肺癌患者身上首次发现KIF5B-RET融合基因,随后陆续出现对RET融合基因进行研究和报道,提示肺癌中存在新的分子亚型—RET融合基因型肺癌。RET基因与其他基因融合已被证实是甲状腺癌症的诱因[9,10,17],现有研究提示它在肺中表达水平低,但是在患者肺中高表达,RET融合基因可能成为LADCs的新驱动基因。
韩国Ju[22]等应用转录组高通量测序技术对1例33岁、无癌症家族史、从不吸烟的男性肺腺癌肝转移灶的标本进行检测,发现了一种新的融合基因:KIF5B-RET,为KIF5B的16号外显子与RET的12号外显子相融合,其肿瘤组织EGFR、KRAS、EML4-ALK均为阴性。随后对20例LADCs样本进行定向测序分析,再次发现2例KIF5B-RET融合基因阳性患者(5例EGFR、KRAS、EML4-ALK均为阴性的LADCs患者中发现1例;15例EGFR、EML4-ALK均阴性的患者中发现1例),阳性率约为6%(4.3%-8%)。RET基因的12号外显子分别与KIF5B的15、23号外显子相融合,这种融合可导致RET原癌基因的高表达。这证实了KIF5B-RET融合型NSCLC的存在,并提示该融合基因可成为肺癌个体化诊治中新的分子靶点。
日本Takeuchi等[23]经分子和组织病理学检测1,529例肺癌(其中1,116例为LADCs)的融合基因表达情况,采用IHC或FISH技术分别分析了ALK、ROS1(sarcoma virus oncogene homolog 1)、RET这3种融合基因的频率分布。共检出71例肺癌患者存在融合基因,其中44例ALK、13例ROS1和14例RET(12例为KIF5B-RET融合,2例为CCDC6-RET融合)。这71例病理类型均为LADCs,即0.9%肺癌(1.2% LADCs)患者存在RET融合基因,且研究发现RET基因的断裂位点相对保守,14例阳性标本中11例位于12外显子,1例位于11外显子,1例未知。该研究中RET融合基因阳性患者EGFR、KRAS为阴性,具有年轻、少吸烟、肿块小的特点,其总生存期(overall survival, OS)与EGFR突变阳性患者相比无明显差别(P=0.32)。该研究通过这71例融合基因确定了4个独立的不良预后因素:年龄≥50岁、男性、高病理分期、融合基因阴性。
日本Kohno等[12]对319例日本肺腺癌标本行RT-PCR和Sanger测序分析显示,6例(1.9%)KIF5B-RET阳性均为非吸烟腺癌,癌组织高表达RET,肿瘤病理类型均为中分化或高分化,同时EGFR、KRAS、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)及ALK均为阴性。RET融合基因存在4种变体(K15:R12,K16:R12,K23:R12,K24:R8)。但是,研究者对80例美国肺癌患者及34例挪威肺腺癌患者进行检测时,仅从1例美国曾经吸烟肺腺癌患者中发现了KIF5B-RET基因融合。KIF5B-RET融合基因在亚裔和非亚裔LADCs中阳性率为1%-2%,而在其他肺癌类型包括234例鳞状细胞癌、l7例大细胞癌、20例小细胞癌中均未检测到KIF5B-RET融合基因;在其他肿瘤的腺癌中,例如卵巢癌(n=100)、结肠癌(n=200)亦未检测到KIF5B-RET融合基因,这一结果提示KIF5B-RET融合基因为LADCs所特有。且RET基因的断裂位点相对保守,以上7例RET阳性样本中6例位于12号外显子,1例位于8号外显子。
美国Dana Farber癌症研究所Capelletti等[24,25]通过二代测序技术检测24例肺癌的常规石蜡包埋组织标本,发现了1例KIF5B-RET融合变异。另外利用IHC技术在117例NSCLC患者中检测到22例RET阳性,对其中15例患者进行测序发现1例携带KIF5B-RET融合基因。检测另外526例(121例白人和405例亚裔)从不或很少吸烟的肺癌患者的融合基因情况,共发现1例白人(0.8%)和9例亚裔(2%)为KIF5B-RET阳性,且所有10例RET融合基因阳性患者均无EGFR、KRAS、Her-2、ALK、ROS1的改变。Capelletti研究的667例肺癌标本中KIF5B-RET基因融合频率约为1.8%(12/667),在没有EGFR、KRAS、Her-2、ALK、ROS1变异的肺癌中,RET基因的融合频率高达6.3%(10/159例)。该研究中发现4种KIF5B-RET融合基因的变体(K15:R12、K16:R12、K22:R12和K15:R11),可以看出RET基因的断裂位点较为保守。
Suehara等[26]综合应用NanoString、せCE和RT-PCR在74例KRAS、EGFR、HER-2、BRAF(murine sarcoma viral oncogene homolog B1)均无突变且ALK融合基因为阴性的LADCs中检测出2例KIF5B-RET阳性患者,其中1例为60岁从不吸烟的女性患者,1例为73岁曾经吸烟的男性患者。
日本Yokota等[27]采用RT-PCR技术及直接测序法对442例术后患者(270例肺腺癌、101例肺鳞癌、60例乳腺癌、11例来自结肠癌和PTC的转移性肺癌)的KIF5B-RET基因状态进行研究,结果检出3例KIF5B-RET阳性且均为LADCs(1.1%),其他172例肺鳞癌、乳腺癌、转移性肺癌的KIF5B-RET融合基因均为阴性。这3例KIF5B-RET阳性患者均为女性,无吸烟史、无EGFR、KRAS、BRAF、ERBB2、EML4-ALK基因变异。
我国季红斌课题组[14]在前期工作中已经揭示了绝大多数LADCs中存在关键致癌驱动基因。只有少数LADCs(24/202)的关键致病基因仍在进一步探究:选取5例EGFR、HER2、KRAS、EML4-ALK均为阴性和12例致癌驱动机制已明确的肿瘤样本进行Affymetrix外显子芯片的分析及实验验证,最终在这些非吸烟LADCs标本中检出1例CCDC6-RET融合基因,并且进一步证实为CCDC6的1号内含子和RET的11号外显子在染色体DNA水平的转位所致。RET是一个受体酪氨酸激酶,在正常的肺组织中表达较低;而融合了CCDC6胞外域以及RET激酶活性区的突变基因,在肺癌样本中往往表达较高,可能是导致肺癌发病的关键所在。
我国复旦大学癌症中心的王瑞博士与陈海泉博士等[18]应用PT-PCR结合实时定量PCR的方法对936例术后NSCLC患者的RET融合基因情况进行研究,再通过IHC和FISH对所得结果进行验证。检测到13例患者(633例腺癌患者中有11例,24例腺鳞状细胞癌患者中有2例)存在RET融合基因,其中9例为KIF5B-RET,3例为CCDC6-RET,1例为首次发现的NCOA4-RET融合基因。RET融合基因阳性的LADCs患者,平均无复发存活期为20.9个月,其肿瘤分化情况较差(63.6%, RET vs ALK,P=0.029; RET vs EGFR, P=0.007),患者年龄偏低(≤60岁;72.7%),不吸烟者(81.8%)多发,并且多见实体亚型(63.6%)、瘤体较小(≤3 cm)、有N2病情(54.4%)。
Drilon[28]报道了在临床研究中应用新一代测序法首次发现1例TRIM33-RET融合基因阳性的NSCLC患者,并进一步证实为TRIM33的14号外显子和RET的12号外显子相融合,且无MET基因突变。
目前已报道的研究显示我国RET融合基因存在于1.4%的NSCLC患者以及1.7%的LADCs患者中[18],国外数据为RET融合基因占NSCLC患者的1%-2%[28](其中KIF5BRET占90%,相继发现的CCDC6-RET、NCOA4-RET、TRIM33-RET数量较少,尚不能得出有力结论),并且该基因具有可识别的临床病理特征,与其他已知的NSCLC分子亚型相互独立、不相重叠,因此可定义为一项全新的分子亚型,对其进行靶向治疗研究,进一步应用于临床工作。
已有研究[29]表明RET融合基因可诱导甲状腺癌的发生,给予RET抑制剂后肿瘤可得到控制,然而在肺癌中相关报道较少。
多靶点激酶抑制剂凡德他尼(vandetanib)是血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2)、EGFR和RET信号通路的抑制剂。一项凡德他尼治疗局部晚期或转移性家族遗传性MTC的II期临床试验[29]结果表明,疾病控制率达到73%,且不良反应可以得到控制;另一项关于MTC的III期临床试验(ZETA)[30]结果显示,凡德他尼组较安慰剂组无进展生存期(progression-free survival, PFS)明显延长,疾病进展风险降低54%。因此,凡德他尼已被美国食品药品管理局批准用于不宜手术切除或转移性MTC的治疗。众多学者对于凡德他尼治疗RET融合基因阳性的NSCLC患者是否有效进行了研究。
Kohno等[12]对仅表达KIF5B-RET融合基因而无其他基因变异的H1299人肺癌细胞进行研究,检测到KIF5BRET蛋白在RET激酶活化环上Tyr905发生磷酸化,证实了KIF5B-RET的融合导致RET激酶异常活化。研究发现凡德他尼(<1 μmol/L)能够抑制转染表达KIF5B-RET融合基因的NIH3T3细胞模型生长及体外克隆形成,提示该药能够抑制Tyr905的磷酸化,抑制KIF5B-RET融合基因的活化。Takeuchi等[23]将转染了KIF5B-RET病毒的3T3细胞接种于裸鼠皮下,可观察到肿瘤形成。凡德他尼能够抑制转染了KIF5B-RET病毒的Ba/F3细胞增殖。Capelletti等[24]进一步发现,转染了KIF5B-RET变体K15:R12的Ba/F3细胞显示出RET的高表达和磷酸化活化,体外实验发现,多靶点激酶抑制剂舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)和凡德他尼均能够抑制KIF5B-RET Ba/F3细胞的增殖,且舒尼替尼能够抑制RET磷酸化,但EGFR-TKI吉非替尼(gefitinib)无以上作用。
目前两项凡德他尼单药治疗NSCLC的III期临床试验正在进行中。关于凡德他尼与厄洛替尼(erlotinib)的对照试验—ZEST试验[31]结果显示两组PFS、客观有效率(objective response rate, ORR)和OS均无明显差异。Lee等[32]设计的ZEPHYR试验将符合条件的患者按2:1的比例随机分到凡德他尼组(300 mg/d)和安慰剂组,接受治疗直至疾病进展或发生不能耐受的毒性反应,该研究的主要目标为OS,最终纳入924例患者,凡德他尼组617例,安慰剂组307例。结果显示,常见的不良事件凡德他尼组多于安慰剂组,包括腹泻(46% vs 11%)、皮疹(42% vs 11%)和高血压(26% vs 3%)。8周时凡德他尼组PFS(危险比=0.63,P<0.001)和ORR(2.6% vs 0.7%, P=0.028)均优于安慰剂组;然而两组的中位OS无差异(8.5个月vs 7.8个月,P=0.527),凡德他尼组PFS的延长未能最终转化为OS的获益。因此,我们期待一项新的随机、双盲、多中心临床试验出现,将筛选出的RET融合基因阳性患者,随机分到凡德他尼组和对照组进行研究,在试验的初期更精确的锁定治疗靶点,或许能够得出更有意义的结果。
Cabozantinib即XL184,是一种口服广谱激酶抑制剂,通过靶向抑制MET(mesenchymal-epithelial transition factor)、VEGFR2 及RET信号通路而发挥抗肿瘤作用,它能够杀死肿瘤细胞,减少转移并抑制血管生成[33]。研究[33]表明Cabozantinib对于RET-PTC的细胞株(IC50为0.06 μM)治疗效果优于阿西替尼(Axitinib)、舒尼替尼、凡德他尼,鉴于此斯隆凯瑟琳癌症中心启动首个Cabozantinib治疗KIF5B-RET阳性的进展期NSCLC患者的II期临床试验(NCT01639508)。Drilon等[28]对此项研究进行了报道,该试验共招募25例符合条件的患者接受口服Cabozantinib 60 mg/d治疗,连续28天为一个周期,直至疾病进展或发生不可耐受的药物相关毒性。该研究主要目标为ORR,次要目标为PFS、OS和不良反应,目前第一阶段已顺利完成,3例经过Cabozantinib治疗的患者中有2例达到部分缓解(RECIST 1.1评价标准):其中1例为TRIM33-RET融合基因阳性患者(这也是首例被报道的TRIM33-RET阳性的NSCLC患者);另外1例KIF5B-RET阳性患者达到稳定。这3例患者目前仍在继续接受治疗,此项研究预计最终于2015年7月全部完成。
分子分型的出现为晚期NSCLC的治疗开创了全新局面。RET融合基因成为NSCLC的一个新的分子亚型,有着独特的临床病理学特征:多为不吸烟(或少吸烟)的较年轻的腺癌患者,其肿瘤分化情况较差,瘤体较小,有N2病情,与其他已知的基因改变不共存,RET抑制剂治疗有效。虽然RET融合基因在肺癌中的发生率很低,但由于肺癌在全世界高发,如能结合临床病理学特点,对EGFR突变、KRAS突变、EML4-ALK基因均阴性的肺腺癌患者进一步行RET融合基因检测,并对阳性患者进行针对性靶向治疗,相信会使更多患者获益。
在肺癌中,RET融合基因的药物临床试验及分子诊断技术方法成为新的研究热点,RET融合型肺癌的诊治模式已经初露端倪。当然,真正形成类似目前EGFR突变型、ALK融合型肺癌的诊治模式,还需要高水平、大规模、前瞻性临床试验的证据支持。目前所检测到RET融合基因阳性的肺癌几乎均为腺癌,类型较为单一,但由于相关研究较少,其他类型肺癌中是否存在RET融合基因、是否还存在其他基因与RET基因融合的现象都有待进一步的探索。多靶点激酶抑制剂凡德他尼、克唑替尼、Cabozantinib等能否成为该分子亚群肺癌治疗的里程碑,也有待更多更深入的实验室研究、转化性研究及大规模前瞻性多中心随机对照临床研究加以佐证。但是我们相信不久的将来会有相应的药物给肺癌患者带来新的希望。