中药干预动脉粥样硬化细胞凋亡研究进展1）

赵彦超，顾 耘

动脉粥样硬化（AS）是一种与脂质代谢异常、血栓形成及遗传环境等因素相关的疾病过程。细胞凋亡存在于AS中已为许多实验所证实，并被认为是AS病变的独立危险因素[1]。细胞凋亡直接影响血管内血栓形成、粥样硬化动脉的形态和结构，以及斑块的稳定性。因而研究中药干预细胞凋亡、保护心血管，已成为当今心血管药物研究的一个新方向。

1 对细胞凋亡信号传导通路的影响

细胞凋亡的信号转导机制十分复杂，目前认为至少有三条通路参与，即线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路。

1.1 线粒体通路 又称内源性凋亡途径，线粒体通路可由多种因素诱发，如细胞脱离了原来的生长环境、失去了赖以生存的生长因子、DNA损伤等[2]。在生理情况下，线粒体通透性转变孔（MPTP）周期性开放，防止膜间隙正离子的过度蓄积。在各种促细胞凋亡信号作用下，MPTP不可逆过度开放，线粒体跨膜电位崩解，细胞色素c（Cytc）等促凋亡活性蛋白释放至胞浆内，Cytc与凋亡蛋白酶活化因子－1（Apaf－1）形成多聚复合体，活化Caspase－9前体，导致下游效应者Caspase－3活化，切割底物使细胞凋亡[3]。这一途径中，活性Caspase－3是级联反应中关键蛋白酶[4]，Bcl－2家族是线粒体凋亡途径的主要调控者，他们通过激活一系列下游基因发挥调节凋亡作用。红花黄色素B[5]、茶多酚[6]、麝香酮[7]均能有效抑制细胞线粒体膜电位损伤后细胞内钙超载，维护线粒体功能，提高线粒体膜电位（MMP），抑制刺激对细胞线粒体的损伤作用导致的细胞凋亡。高培国等[8]研究发现，氧化应激可诱导细胞凋亡，葛根素可通过拮抗过氧化氢对线粒体膜的脂质过氧化反应，保持线粒体膜的完整性，维持线粒体膜电位，减少线粒体损伤率，降低Caspase－3阳性表达率，阻断细胞凋亡的信号传导通路，达到保护细胞的目的。李响等[9]研究表明，注射用血栓通可以防止线粒体损伤，提高Bcl－2表达水平，减少Cytc的释放，减低Caspase－3活性来拮抗血管内皮细胞凋亡。蒙果等[10]研究发现金钠多中所含银杏黄酮可以阻止MMP的下降和保持膜的完整性，从而抑制线粒体Cytc释放和细胞凋亡发生。

1.2 死亡受体通路 该途径也称外源性凋亡途径，死亡受体中最典型的是Fas和TNFRs。①Fas／FasL死亡通路：FasL可与Fas结合，募集FADD（Fas相关死亡结构域蛋白）后形成了死亡诱导信号复合物（DISC），激活Procaspase－8，进一步自我激活启动下游的Caspase相关蛋白酶级联反应，最终导致细胞凋亡。该通路中，DISC的形成是级联反应的关键步骤[11]。②TNFR死亡通路：TNFRs当与TNF结合后，TNFR－I三聚体化，然后募集一个衔接蛋白 TRADD（TNFR－associated death domain）。TRADD可以引起两条信号转导通路的激活，①通过招募FADD诱导细胞凋亡；②通过肿瘤坏死因子受体相关蛋白2（TRAF－2）和诱导转录因子（RIP）活化。TRAF－2和 RIP活化NF－κB诱导激酶（NIK），NIK使IκB发生磷酸化，并促进 NF－κB的降解和释放，后者转位至核，激活一系列基因表达[12]，导致细胞凋亡发生。甄艳军等[13]实验显示，木贼提取物能致血管平滑肌（SMC）膜表面Fas大量表达，增加死亡受体与配体结合的细胞毒作用介导SMC的凋亡，而且凋亡率与Fas、FasL表达量成正相关，两者结合触发的凋亡效应可清除增生的SMC，减轻内膜增生，使AS早期SMC增殖与凋亡趋于平衡，减轻AS早期病变。尚秀玲[14]予白藜芦醇干预动脉粥样硬化家兔，结果显示白藜芦醇能明显降低家兔主动脉FasmRNA、FasLmRNA、Caspase－3mRNA表 达，且 Caspase－3mRNA 表 达 与 FasmRNA表达水平呈显著正相关，通过抑制Fas／FasL途径来抗AS斑块内细胞凋亡。林蓉等[15]研究槲皮素对TNF－α损伤的内皮细胞发现，TNF－α使ECV核内NF－κB表达增加，而槲皮素能降低内皮细胞NF－κB的表达，抑制其活化，减少其降解和释放。

1.3 内质网通路 内质网应激（ERS）是指很多病理生理刺激，如氧化应激、缺血缺氧、钙稳态紊乱及病毒感染等，能够引起内质网腔内未折叠与错误折叠蛋白蓄积以及Ca2＋平衡紊乱。适度的ERS可通过促进内质网处理未折叠及错误折叠蛋白等降低损伤；而持久或严重的ERS则可引起细胞凋亡[16]。目前，已知内质网应激诱导细胞凋亡的途径有3条：①CHOP／GADD153基因的激活转录；②JNK的激活通路；③内质网特有的半胱氨酸蛋白酶Caspase－12的激活通路[17]。其中，CHOP通路是调节内质网应激诱导凋亡的主要通路。葡萄糖调节蛋白（GRP78）作为一种分子伴侣在蛋白质的折叠和转运过程中发挥重要作用，通过“异常折叠蛋白质反应”途径激活ERS[18]，魏晏等[19]研究发现，经淫羊霍苷（ICA）预处理的同型半胱氨酸（HCY）诱导的内皮细胞内GRP78mRNA表达明显减少，且未见明显凋亡形态学改变，考虑减缓血管内皮细胞内质网应激可能是ICA抗细胞凋亡作用的机制之一。高雪等[20]以体外培养HUVECs，通过Ang－Ⅱ诱导细胞凋亡的发生，观察盐酸川芎嗪（TMP·HCl）对凋亡细胞的作用，发现Ang－Ⅱ诱导细胞很快激活细胞内ERK1／2、JNK，引起细胞损伤。予盐酸川芎嗪预保护的细胞ERK和JNK磷酸化程度随药物浓度增高而降低，其激活程度与TMP·HCl浓度成反比。表明TMP·HCl能抑制ERK、JNK的信号通路来保护内皮细胞。

2 对细胞凋亡调控蛋白的作用

Caspase家族和Bcl－2家族在凋亡的发生发展过程中起着举足轻重的作用。Caspases家族是凋亡活化因子，是引起细胞凋亡的关键酶，是凋亡通路的核心执行者。Bcl－2家族蛋白是调节细胞凋亡的关键元件，分为3类：促凋亡蛋白，如Bak和Bax；抗凋亡蛋白，如 Bcl－2和 Bcl－xL 以及 Bim、Bid等 BH3－only蛋白，BH3－only是一类促凋亡蛋白，通过抑制Bcl－2抗凋亡成员的活性或激活Bax／Bak样促凋亡成员的活性来调节细胞凋亡。王燕[21]研究发现，用含硒29.403mg／kg的富硒大蒜油能够降低Bax和Caspase－3蛋白表达量，使Bcl－2蛋白表达量显著升高，通过作用于基因转录水平逆转Bax、Bcl－2和Caspase－3的蛋白表达，从而抑制内皮细胞凋亡。郭峰等[22]实验发现迷迭香酸预处理可以增加凋亡细胞中Bcl－2蛋白的表达，减少Bax蛋白的表达，升高Bcl－2／Bax的蛋白比值，降低Fas、FasL的蛋白表达。潘露茜等[23]实验发现，软脉煎可以从蛋白水平调节血管平滑肌细胞凋亡，软脉煎干预后细胞Caspase－8蛋白表达显著降低，提示软脉煎能通过干预细胞凋亡信号途径中的多信号途径介质Caspase－8来抑制凋亡。严玉平等[24]应用乌鸡白凤丸治疗动脉粥样硬化大鼠研究发现，Caspase－3蛋白表达下调，血管内皮细胞凋亡率降低，增殖指数增加。何煜舟[25]体外实验发现，木犀草素抑制H2O2诱导内皮细胞凋亡途径涉及Caspase－3通路。该药可显著抑制Caspase－3阳性表达，减少内皮细胞凋亡数量。

3 结 语

从细胞凋亡角度探讨中药干预心血管疾病的发生、发展机制是目前研究的热点，无论是对凋亡的诱发因素，还是信号传导通路及调控蛋白的研究都取得一定的成就，涉及的药物包括中药提取出的单体、有效成分以及单味药和复方制剂。但是中药抗细胞凋亡的分子学机制十分复杂，其药理学基础涉及多个环节，因而目前仍存在着不足。①细胞凋亡系统本身分子机制未能阐明的十分透彻，因而中药对各凋亡传导通路作用的研究大多只停留在表面，更深层次的研究很少。②中药本身成分的复杂，使得其作用多靶点、多层次，大部分研究只显示中药对细胞凋亡的有效性，而有效成分及凋亡作用机制有待进一步研究。③目前大部分实验研究为单因素诱导的细胞凋亡体外实验，且处于初步试验阶段，不能真正地模拟相应体内病变及中药干预的全面情况，人体是一个复杂的系统，因而在体内多因素参与下中药对细胞凋亡的网络式调控机制是需要研究和完善的重点。④从目前对凋亡研究的中药来看，以活血药物居多，呈现了药物研究的局限性。

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