制备诱导多能干细胞的分子系统

刘浏，马晴雯

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）在形态学特征、表面抗原、基因表达模式及表观遗传状态等方面与胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）类似[1-4]，注射裸鼠后也同样可以在体内形成含有 3 个胚层的畸胎 瘤[1,4]，甚至能像 ESCs 一样通过四倍体补偿技术获得具有生殖能力的活体小鼠[5-6]。在实际应用中，iPSCs 可避免 ESCs 的诸多弊端，如伦理问题、胚胎来源的选择、安全性问题等，因此，越来越多的文献报道了 iPSCs 在再生医学、疾病模型的建立、细胞及基因治疗、药物的发现与评价等方面的研究和应用[7-10]。

成功获得 iPSCs 的关键环节之一是将外源性的转录因子导入到要诱导的体细胞中，并使之高效重编程。这些外源性因子可以是最初的 Yamanaka 四因子：Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4[1]，或 Thomson 四因子：Oct4、Sox2、Nanog 和 Lin28[11]，也可以是其他转录因子的组合，例如，3 个转录因子：Oct4，Sox2 和 Klf4，即四因子中除去了 c-Myc，但是重编程效率降低了许多[12]；两个转录因子 Oct4 和 Sox2 与小分子化合物丙戊酸（VPA）联合使用也可产生 iPSCs[13-14]；另外，在小鼠神经干细胞中，因其内源性高表达 Sox2 和 c-Myc，使用两个转录因子 Oct4 和 Klf4 即可诱导其成为 iPSCs[15]，甚至单独使用转录因子 Oct4 也可得到 iPSCs[16]。本文总结了制备 iPSCs 的基因转移系统、蛋白诱导系统和 RNA 相关诱导方法的优势和限制因素。

1 基因转移系统

1.1 病毒载体

1.1.1 整合型 用于获得 iPSCs 的整合型病毒载体主要有逆转录病毒载体（retroviral vectors，RV）和慢病毒载体（lentiviral vector，LV）两种，其中逆转录病毒是一种 RNA 病毒，不能自主复制，但是可以通过编码逆转录酶，使病毒基因组的 RNA 逆转录为 DNA，并随机整合到宿主细胞的基因组中，随宿主 DNA 一同进行复制，因此其只能感染处于分裂期的细胞。Yamanaka 等第一次成功得到 iPSCs 就是应用逆转录病毒载体将 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 4 种转录因子整合入小鼠胚胎成纤维细胞和尾尖成纤维细胞的基因组[1]。慢病毒载体属于逆转录病毒载体的一个亚类，其既可感染分裂期细胞又可感染非分裂期细胞[17]，研究发现慢病毒载体对于易引发肿瘤的整合位点的易感性比逆转录病毒载体低[18]。Yu 等[3]分别将 4 种转录因子（Oct4、Sox2、Nanog 和 Lin28）连入慢病毒载体，将人成纤维细胞诱导为 iPSCs。

但上述方法需要感染多个病毒载体，增加了基因突变率和基因组的不稳定性。随后科学家们成功地利用一个多顺反子慢病毒载体得到了 iPSCs，即 4 种转录因子在同一个开放阅读框（open reading frame，ORF）内，不需多个病毒载体同时感染，插入突变率相对降低，重编程效率也相对提 高[19-22]。但这类整合型病毒载体依然存在严重的安全隐患，如插入突变等，且插入的转录因子如 c-Myc[4,23]和 Klf4[24]有致癌作用，可导致肿瘤的形成。另外，即使很低的病毒载体表达水平都有可能改变 iPSCs 的分化潜能或导致恶性转化[25-26]，残余转录因子基因的表达也会影响 iPSCs 的分子特征[27]。因此，如何获得无转录因子、无载体的 iPSCs（transgene and vector-free iPS cells）是制备 iPSCs 研究领域的一个重要方面。

将 Cre/loxP 重组系统与病毒载体系统联合使用，使其成为一个可切除的整合型病毒载体，可作为制备无外源转 录因子的 iPSCs 的理想系统。Soldner 等[27]利用含有 Cre/loxP 重组系统的病毒载体成功地将人成纤维细胞诱导为无外源转录因子的 iPSCs。Cre/loxP 重组系统包括 Cre 重组酶和 loxP 位点两部分[28-29]，来源于大肠杆菌 Pl 噬菌体的 Cre 重组酶是一个位点特异性的 DNA 重组蛋白[30]，它能催化两个 loxP 位点之间的重组反应。Soldner 等在含有转录因子的病毒载体的 3' 长末端重复序列（long terminal repeat，LTR）加入 loxP 序列，这样的病毒载体转染人成纤维细胞后，经过复制在 5'LTR 也形成了一个 loxP 位点。因此，整合发生后转录因子基因两侧就各含有一个 loxP 位点。在瞬时表达 Cre 重组酶的情况下，可实现转录因子基因的切除。这样就得到了无外源转录因子的 iPSCs[27]。通过全基因组转录水平分析，这种转录因子被切除的 iPSCs 与传统的不切除转录因子的 iPSCs 相比，更接近人的胚胎干细胞[27]。

1.1.2 非整合型 腺病毒载体属于非整合型病毒载体，无论宿主细胞处于分裂期还是非分裂期，均可高效转染[31-32]，其转染方式为瞬时转染，几乎不整合入宿主细胞的基因组中，因此大大降低了发生插入突变的风险。Stadtfeld 等[33]以腺病毒载体作为转录因子的转移系统将小鼠的成纤维细胞和肝脏细胞诱导成为 iPSCs。但是用腺病毒载体得到的 iPSCs 的重编程效率很低，可以通过加入一些化学小分子的 方法来提高细胞的重编程效率[34]。

1.2 非病毒载体

1.2.1 非整合型 Okita 等[35]利用质粒载体作为转录因子的转移系统成功地将小鼠胚胎成纤维细胞诱导为 iPSCs。实验中反复转染了两种表达质粒，一种质粒包含有 Oct4、Sox2 和 Klf4 3 种转录因子的互补 DNA（cDNA）；另一种质粒包含有 c-Myc 的 cDNA。利用传统质粒转染的方法虽然能够得到 iPSCs，但是效率极低，从而在一定程度上阻碍了其临床试验应用。

Jia 等[36]使用 minicircle DNA 作为基因转移的载体，成功地将人脂肪干细胞（human adipose stem cells，hASCs）和成纤维细胞诱导成了 iPSCs，且转染 minicircle DNA 后对 hASCs 内的 RNA 进行的定量 PCR 和光学计数分析证实 minicircle DNA 作为载体时，转录因子的表达水平明显高于普通质粒载体。Minicircle DNA 是一种超螺旋的 DNA 分子，它是亲本质粒（parental plasmid，PP）发生自身位点特异性重组的产物。与传统质粒载体相比，minicircle DNA 作为载体去除了细菌骨架的绝大部分基因序列，如复制起始位点和抗性基因等，并且其序列大小与传统质粒载体相比明显小了很多，因此 minicircle DNA 作为基因转移的载体具有安全性好、转化效率高、转基因表达水平高等优 点[37-39]，可以作为获得 iPSCs 的理想载体。

另外，Yu 等[40]利用 oriP/EBNA1 载体通过一次转染即成功地将人成纤维细胞诱导成为 iPSCs，此后这种质粒载体在无药物筛选的条件下从细胞中消失，从而得到无转录因子、无载体的 iPSCs。oriP/EBNA1 载体在哺乳动物细胞染色体外的稳定复制仅需要一个顺式作用元件 oriP 和一个反式作用因子 EBNA1 的参与。这种非整合型载体避免了传统整合型病毒载体的缺点，同时证明外源重编程因子不需要整合到细胞基因组，也不需要持续表达，即可获得 iPSCs，为 iPSCs 应用于临床试验扫除了一个障碍，但与其他非整合型载体一样，该系统重编程效率极低。

1.2.2 整合型 piggyback（PB）转座子不受宿主细胞的制约，且已被证实在包括人和小鼠在内的多种细胞系中发挥作用。PB 转座子（转座酶）系统作为生产 iPSCs 的基因转移系统时，需要两个表达载体，即转座子和转座酶的表达载体。将这两种表达载体共转染宿主细胞后，在转座酶的作用下，转座子的表达载体将 4 种转录因子整合入要诱导的体细胞基因组中获得 iPSCs。随后在 iPSCs 中再瞬时转染适量转座酶表达载体，其表达的转座酶可使转座子表达载体在基因组插入位点处发生无缝切除，从而获得更安全的无转录因子、无载体的诱导多能干细胞[41-42]。Wohjen 等[41]就是通过这种 PB 转座子（转座酶）系统将转录因子导入细胞中，成功地将小鼠和人胚胎样成纤维细胞诱导为无转录因子、无载体的 iPSCs，安全性大大提高。但是 PB 转座子的无缝切除作用不够精确[43]，于是，Guo 等[44]联合使用 PB 转座子与 Cre/loxP 重组系统，在 Cre/loxP 重组系统的切除作用下，成功地将小鼠外胚层干细胞（epistem cell，EpiSC）诱 导成为无转录因子、无载体的 iPSCs。

另外，Ye 等[45]利用噬菌体 ΦC31 整合酶系统成功地将小鼠胚胎成纤维细胞、人羊水细胞诱导为 iPSCs。ΦC31 整合酶属于位点特异性的丝氨酸重组酶类，可催化细菌附着位点（bacterial attachment site，attB）和噬菌体附着位点（phage attachment site，attP）发生重组并生成 attL 和 attR 序列。真核细胞内转染含有 attB 的质粒后，在 ΦC31 整合酶的催化作用下同样可以发生位点特异性的重组反应，基因组中的重组位点与野生 attP 位点具有序列相似性，被称为假 attP 位点[46-47]。ΦC31 整合酶介导的整合反应倾向于将外源基因整合到基因间区域，这就使得靶细胞基因组被破坏的风险明显低于随机整合[45,48]。为了获得无转录因子的 iPSCs，Karow 等[49]将 ΦC31 整合酶与 Cre/loxP 重组系统联合应用。ΦC31 整合酶将转录因子整合入宿主基因组中，诱导产生 iPSCs 之后，通过脂质转染表达 Cre 重组酶的质粒，在 Cre/loxP 重组系统的作用下将整合的转录因子从基因组中删除，成功地将小鼠成纤维细胞和脂肪干细胞诱导为无转录因子的 iPSCs。

2 蛋白诱导系统

2.1 细胞穿透肽

细胞穿透肽（cell penetrating peptide，CPP）是一种可以与化合物或蛋白质结合并转导它们跨越细胞膜的载体[50]。多聚精氨酸肽由 6 ～ 12 个精氨酸残基组成，其中由 11 个精氨酸残基组成的 CPP（11R）的转导能力最强[51]。Zhou 和 Kim 等均成功利用多聚精氨酸肽融合的四因子获得了蛋白诱导多能干细胞（protein-induced pluripotent stem cells，piPSCs）[52-53]。Zhou 等[52]结合使用化学小分子丙戊酸，直接将诱导细胞重编程的四因子 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 以 11R-C 端融合蛋白的形式导入小鼠成纤维细胞中，第一次成功获得蛋白质诱导的 iPSCs。同年，Kim 等[53]将 9R 融合的 4 个转录因子蛋白导入人成纤维细胞中，第一次成功获得蛋白诱导的人 iPSCs。

2.2 人类免疫缺陷病毒反式激活肽

人类免疫缺陷病毒反式激活肽（HIV-TAT）能够高效并且快速地转导多种蛋白质跨膜，其功能结构基础是一个由 47 ～ 57 个氨基酸残基组成的富含酸性氨基酸的区域，这部分 TAT 被称为蛋白转导域（protein transduction domain，PTD）[54]。

Zhang 等[55]利用 TAT-重编程融合蛋白（TAT-RFs）成功诱导人包皮成纤维细胞（human foreskin fibroblast，HFF）为 iPSCs，且使用 5 种 TAT-RFs（Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog）要比使用 4 种 TAT-RFs（Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4）更容易获得 iPSCs。另外，还发现 TAT 和 11R 转导效率几乎都为 100%，但就初始重编程效率而言，TAT-RFs 要明显优于 11R-RFs。

这种蛋白诱导的重编程方法不需要基因载体系统的参与，对宿主细胞基因组 DNA 不会产生任何的影响，但目 前只有 11R、9R 和 TAT 这 3 种蛋白转导载体被成功应用获得 piPSCs，该技术仍然处于早期发展阶段。其最大的缺点是重编程效率非常低，与一些质粒载体及游离型载体几乎相同，比整合型病毒载体或转座子载体低 1000 倍[56]。不过，Li 等[57]研究发现当 TAT 复合阳离子脂质体（Lipo-Tat）使用时，其转导效率可显著增加 1000 倍。另外，Hitsuda 等[58]发现 3 个精氨酸残基（3R-p53）结合吡啶（pyrenebutyrate）使用时，p53 的活性较 11R-p53 高，是一种高效的蛋白转导载体。然而，到目前为止，上述这些最新研究的转导载体还未成功地应用于制备 piPSCs 的研究中，仍需要更严密的实验去证明这些蛋白转导载体是否能够更有效地激活重编程过程。

3 RNA 相关的诱导方法

piPSCs 为科学家们获得诱导多能干细胞提供了新思路，但因蛋白直接导入宿主细胞效率低、蛋白纯化操作难度大、重编程效率低等问题，RNA 相关的诱导方法被许多科学家们所重视。仙台病毒（sendai virus）是一种 RNA 病毒，不会插入基因组，重编程效率相对较高，有不少科学家利用其为载体成功制备 iPSCs[59-61]，但其毕竟是病毒载体，安全隐患不能排除。2010 年，Warren 等[62]将诱导细胞重编程的转录因子以 mRNA 形式导入人成纤维细胞，成功获得核糖核酸诱导的多能干细胞（RNA-induced pluripotent stem cells，RiPSCs），且 mRNA 诱导系统获得 iPSCs 的效率是逆转录病毒载体系统的 36 倍，重编程速度是逆转录病毒载体的 2 倍。

2011 年，Anokye-Danso 等[63]利用 miR302/367 簇诱导小鼠和人的成纤维细胞生成了 iPSCs，与传统的转录因子诱导方法（包括上述 Warren 等的 mRNA 诱导方法）相比，其重编程效率大大提高。他们分析 miRNAs 之所以能诱导获得 iPSCs，可能与激活 Oct4 并抑制 HDAC2（组蛋白脱乙酰基酶）的活性有关。但是该方法用的是慢病毒载体转染的方法，而不是直接转染成熟的 miRNAs。同年，Miyoshi 等[64]直接转染 3 个成熟 miRNAs（miR-200c、-302c 和 -369c）到小鼠和人的脂肪干细胞中成功生成 iPSCs。利用此方法获得 iPSCs 效率相对较低，但因不涉及病毒载体的使用，安全性大大提高。另外，2012 年，Foja 等[65]发现结合成纤维细胞生长因子 2（FGF2）和缺氧培养，能够有效地促进骨髓间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）的重编程，其原因可能与诱导产生内源性 MSC 特异的 miR-302 簇并激活 Oct4 和 Nanog 有关。

4 结论和展望

从已报道的文献来看，目前用于制备 iPSCs 的分子系统优化改造思路主要有以下三方面：

⑴尽可能地弃用或替换 c-Myc[4,23]和 Klf4[24]转录因子，因为两者均具有导致细胞异常增生的作用，将诱导成功的 iPSCs 用于患者体内进行临床治疗时有引发癌症的潜在 风险。

⑵寻找更安全的基因转移系统。由于多数病毒载体可整合到靶细胞基因组中，存在发生插入突变或激活癌基因等导致基因组不稳定的风险，近年来不少实验室尝试使用不同类型的载体系统，如传统质粒载体[35]、oriP/EBNA1 系统[40]、PB 转座子系统[41-42]、ΦC31 整合酶系统[43]等，来替代病毒载体，寻求更安全高效生产 iPSCs 的基因转移系统。这些非病毒载体都可成功地将体细胞诱导为 iPSCs，但重编程效率非常低。另外，多种基因转移系统相结合，如 Cre/loxP 重组系统分别与病毒载体系统[27]、ΦC31 整合酶系统[49]、PB 转座系统[44]等联合使用，在 iPSCs 成功诱导后删除外源转录因子，可提高 iPSCs 的安全性。

⑶非 DNA 转移系统的使用。虽然上述非整合型载体在一定程度上避免了插入突变等风险，但其毕竟为 DNA 载体系统，不能完全排除没有任何基因组修饰现象的发生，仍有染色体插入突变而引起肿瘤发生的可能，具有实际应用的局限性。通过重编程蛋白、mRNA 或 miRNAs 来诱导获得 iPSCs 克服了潜在的安全风险，因此，这些方法拥有更好的应用前景。

另外，体细胞在重编程的过程中引入一些小分子化合物如 5-氮（杂）胞苷、丙戊酸、维生素 C 等可提高重编程效率[66-68]，但这些小分子化合物系统仅能替代某个转录因子，并不能起到关键性诱导重编程的作用。因此，上述 DNA、RNA、蛋白质诱导系统依然是 iPSCs 研究领域的热点，尤其是 RNA、蛋白质诱导系统，为制备 iPSCs 的研究提供了新思路。随着 iPS 诱导机制、安全性及诱导效率的深入研究，相信 iPSCs 从实验室走向临床并不遥远。

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