生物样本质量的影响因素与评估

胡颖，张连海，宋丽洁，王易雪，季加孚

样本质量是整个样本库的核心，样本应该在尽可能严格的条件下进行采集、处理、保存、运输以及后期加工。样本库的工作就是尽可能地将对样本质量的影响降低到最小，除了严格质量管理的制度外，新技术的不断研发、理论研究的不断丰富将有助于评估影响样本质量的因素，从而制定或改进有关样本的标准流程以尽量减少样本质量的变化，保持样本的原有性质。

目前将影响样本质量以及最终影响样本相关检测结果的因素笼统地分为两类：分析前因素或变量（pre-analytical factors or variables）与分析因素（analytical factors）。其中，分析前因素对样本质量的影响较大，而分析因素主要是在分析过程中采用对照、标准化等措施尽可能减少分析前因素造成的影响，尽量反映样本的真实情况，它也决定了最终的分析结果。

因此，在进行样本分析之前，首先要了解有多种因素决定样本的质量——分析前因素或变量。这些分析前因素，包括生物变异、样本收集、处理和贮存等的技术差异，将导致分析前样本的状态与样本在患者体内的状态存在差异。

1 生物样本质量的影响因素

1.1 分析前因素

分析前因素按照时间先后可划分为三类：样本采集前患者状态；样本的采集以及样本采集后到分析前所经历的处理过程[1]。表 1 列举了常见的影响样本质量的分析前因素。

表1 常见的影响样本质量的分析前因素

1.1.1 样本采集前患者的状态 研究表明分析物的水平可能会受各种因素影响，如患者的整体健康状态、采样前摄入的食品和饮料、用药情况、甚至采集所处一天内的时间。额外的因素，如女性月经周期的不同阶段也可能会影响一些下游的分析，应努力收集和记录有关这些变量的信息。

1.1.2 样本的采集过程 从患者处收集生物样本可能会影响生物样本的质量。相关研究已经明确表明，在生物样本离体后热缺血的时间会影响分析结果的总体特征和水平[2]。因此，生物样本从患者体内取出后应该尽快保存，比如分割成适当的大小，快速冷冻或者放入适当的保护液中保存。当生物样本从患者处采集时，生物样本被移除的位置（如肿瘤或非肿瘤，以及在肿瘤内部的位置），任何被使用的麻醉剂，组织器官血液断流的时间，任何在切除后用于稳定保存生物样本的试剂，各种类型的固定方式和暴露在各种固定试剂中的时间，以及生物样本在采集后所处的温度都可能会影响分子的稳定性和降解的速度。

因此，在收集离体后的生物样本时，应该有计划地对生物样本进行适当的注释。这些注释应该包括患者的信息和采集、处理的时间，例如清洁剂的类型、样本处理过程中石蜡的类型和温度等。这些数据应该保存在一个数据库里以便随时查阅。

1.1.3 分析前的样本处理 尽所有可能尝试并优化处理，从而将生物样本处置过程中的分子变化降低到最小。这不仅包括生物样本处理的温度和时间，还应考虑诸如以何种大小和容量的容器进行存储，以备将来使用。较小的样本仅允许尽可能少的冻融。当样品存储在冰冻状态下时，它们被冷却到储存温度的速率也会影响分子降解的速度。储存到样本应用前的其他因素，诸如运输条件、温度变化等也会影响到样本的质量，从而影响到样本最终的检测结果。

针对以上这些分析前因素，美国国家癌症研究所生物样本库和生物样本研究办公室推荐使用代码形式进行标识[3]。该标识将组织和血液样本进行了区分。虽然增加了工作量，但是的确为今后样本流程持续改进提供了重要证据。该编码系统针对液体和固体采用不同的代码，代码为 7 位，分别代表样本的多项分析前参数，下面是采用该代码的实例：

液体 PL2-SED-B-B-E-A-G

（PL2）样本类型：血浆 2 次离心；（SED）储存容器：EDTA 抗凝；（B）离心前时间：3 ～ 7 ℃，< 2 h；（B）离心：< 3000 × g，室温 10 min；（E）二次离心：室温 10 min （3000 ～ 6000）× g；（A）离心后时间：< 1 h，3 ～ 7 ℃；（G）储存条件：–85 ～ –60 ℃ 细管储存。

固体 TIS-BPS-N-B-RNL-A-A

（TIS）样本类型：固体组织；（BPS）采集类型：活检；（N）热缺血时间：不适用（例如活检）；（B）冷缺血时间：2 ～ 10 min；（RNL）固定类型：RNA later；（A）固定时间：< 15 min；（A）储存条件：PP 管 0.5 ～ 2 ml，–85 ～ –60 ℃。

这种使用代码标识的方法，较为规范地给每份样本附上分析前因素的情况，虽然繁琐，但方便了今后对样本的质量进行追溯。

1.2 分析因素

当样本进入特定的分析阶段时，分析前因素带入特定分析中，将给分析结果带来不同程度的影响。而分析因素主要是在分析过程中采用对照、标准化等措施尽可能减少分析前因素造成的影响，尽量反映样本的真实情况。同时，分析因素也可以增加检测的可重复性，确保试验结果稳定可靠。实际操作中，应考虑以下的分析相关因素：①为确保研究的准确性，有可能的话，尽量进行验证研究；②对技术人员进行检测流程的标准化培训；③试剂种类、批号尽量保持一致；④包含适当类型和数量的质量控制（参考）样品；⑤研究过程中样本的取舍应该尽量做到随机；⑥采用标准化的方法来记录和解释测试结果。

将影响样本质量的分析前因素与分析因素进行细化，可以提高样本的质量，但更为重要的是通过这样接近量化的标识与管理，为样本库标准作业程序（standard operation procedure，SOP）[4-5]的建立提供可以量化的依据。为了获得高质量的样本，减少不规范操作流程对样本质量造成的影响，增加后续分析结果的可靠性，需要建立标准操作规程，并通过测量因素对结果的影响不断地改进现有的标准作业程序。也就是：样本的日常工作所参照的作业指导书所基于的证据的主要来源是分析前后样本的检测数据，通过详细记录分析前变量，结合之后的分析结果，测算变量对结果的影响，从而得出评估现行的 SOP 流程规划，提出改进的意见与建议。

2 样本质量的评估

由于分析前因素的存在，因此需要对样本质量进行测定，从而了解在生物样本的采集、处理、储存、运输等环节中的处理方式对样本分子水平的变化，乃至测试结果的影 响[6]。对样本质量进行评估应该是较为全面的，或有针对性的，样本质量评估通常是指从病理形态、分子水平和特定指标等方面对样本进行评价并判断其是否符合质量标准。通过分析库存标本的 DNA、RNA、蛋白质或者特定的分子成分，定期对保存的样本质量进行监控，了解样本质量，同时探索影响样本质量的因素，从而有效地对样本库流程进行持续 改进。

对于样本质量评估，首先要明确的一个概念就是评价样本好坏的标准并不是一成不变的“死标准”。不同样本和对样本的不同使用要求决定了样本质量标准和检测方法不尽相同。针对进行某一特定研究内容的特定类型的样本，质 量检测过程应该建立标准的流程，使用标准参考方案、标准品、标准参考试剂，以及尽可能使用质量稳定的可参考标准生物样本（例如质量确认的体外培养细胞）等，并保证标准品的研究结果可重复。

另外，由于现有技术水平的限制，检测生物样本中每一个部分的质量情况是不可能实现的，因此，目前检测通常只评价某一特定环境条件下生物样本分子成分的总体稳定程度。如果后期研究中将主要涉及某一个或多个特定的分子，就必须就这些特定的分子针对性地进行检测。

检测的方案尽量采用经典的、广泛认可的试验技术。但即便是那些经典的技术，也应该反复测定以保证技术本身随时间的变化仍能保持稳定。国际生物和环境资源协会推荐“能力证据”测试（“proof of performance” test），即在一定时间范围内测试复制的同一样本，以测算检测方法的标准偏差。通过确立类似这样的检测，以确保存储和处理过程有利于保证生物样本中分子成分与质量。其中内容有：

2.1 质量评估需制定标准和建立标准化操作程序

每个生物资源库都应有一套完整的样本质量评估体系。样本库应根据质量管理的要求，样本质量保证的标准以及样本库的实际情况，建立适合本样本库的质量管理体系并形成书面文件，然后实施和保持并持续改进以保证体系的有效性。评估的准确性和稳定性受操作水平的影响，因此，应保证评估人员必须是独立的，有经验或者经过相关培训。

2.2 建立定期随机抽检机制

质量评价是一个系统性的工作，需要建立完善的制度保证其规律实施，这个制度就是定期随机抽检机制。定期随机抽检就是周期性地从样本库保存的所有样本中按照随机抽样的原则，抽取一定比例的样本进行质量评价。根据样本评价结果判断样本储存是否存在问题，进而及时发现问题并改正。

2.3 重视质量反馈

生物样本库的一个重要作用是为研究人员提供实验样品。样本库在向使用者提供样本的同时应该将该样本相关的质量评估信息同时提供给使用者，以便使用者判断该样本是否能用于特定的研究。同时，样本的使用过程本身就是对样本质量进行检测的过程，因此使用者对样本质量的反馈信 息对于样本质量控制有着重要意义，应该予以重视。根据反 馈意见评估样本的质量，并改进采集、储存以及处理样本的方法。

2.4 确认过程中人员的职责

确认程序应对确认过程中样本库相关人员的具体责任做出明确的规定，一般而言，安排如下：①样本库负责人批准选用的检验方法；②技术负责人负责对检测方法进行确认和评审，以及对作业指导书进行审核；③实际检测人员负责编制检测方法作业指导书，并验证检测方法。

2.5 质量检测的内容

样本库储存的样本一般为组织样本、血液样本以及提取的衍生分子样本等。针对不同样本可选用不同方法从病理形 态、分子水平上对样本进行评估。目前没有特别理想的针对血液（比如血清、血浆等）的通用质量检测手段，严格的流程质量控制是目前血液类样本主要的质量保证手段。目前较多质量评估的方法主要是针对冰冻组织样本。

2.5.1 组织样本病理评价 通常的组织样本在进入样本库前或者进入后的短时间内，需要对样本的病理状况进行评 价。有时也将评价放在后续项目研究前进行。但是无论如何，组织样本的病理评价都应该是必须的（图 1）。

图1 冰冻组织的病理检测报告

图2 常见的组织样本 RNA 质量检测结果

样本库储存的样本会与实际整体样本存在差异。尽管样本通常都会附有相关采集单位的病理报告，但是由于采集部位与实际病理取材部位在组织器官内部的差异，样本库实际保存的样本与病理报告中的组织仍存在一定差异，有时这种 差异会大到足以影响研究的结果。以恶性肿瘤为例，常见的不一致包括：肿瘤含量与分布、分化程度、肿瘤亚类的区别等。举个实际遇到的例子：病理由于多点取材而且切片面积较大，报告肿瘤组织中同时含有腺癌成分与内分泌癌成分，而样本研究前冰冻组织切片病理显示细胞形态与腺癌不同，后免疫组化考虑取材样本为神经内分泌癌来源。

此外，笔者对同一样本、同一次取材的不同分装进行病理分析发现，虽然是同一样本的同一次取材，但是分装不同，组织内的分化程度和肿瘤含量比例也不同。另外，还有一点容易忽略的是当病理诊断医师采用的标准不同时，也会导致数据差异较大，因此，尽量采用相同的标准，必要时需要与病理医师进行沟通。

在完成病理评估之后，往往要根据研究内容的需要对组织进行修剪，诸如去掉多余的间质成分，比如 RNA 表达的研究往往要求肿瘤组织成分在 70% 以上，而 DNA 水平的研究对组织成分的要求会更高。

对于活检组织样本的病理评估一般较难，冰冻切片后往往组织损失较大，活检当时的组织印片是一个比较可行的病理评估手段。

总之，忽略研究前对生物组织样本的病理评价将对结果产生严重的影响。

2.5.2 常见生物样本的总体分子水平评价 一般来说，样本库的质量评价很少针对特定的分子指标，往往是总体分子水平的评价。一般来说，RNA 相对于 DNA 更容易发生破坏和降解，通常多数研究者将 RNA 的完整性作为评价样本质量的重要指标。而特定的分子水平或者特定分子的评价需要有针对性地完成。

由于 DNA、RNA、蛋白的提取方法在一般的分子生物学指南中都有详细描述，这里就不再叙述。常见的质控报告见图 2。

总之，通过对生物样本质量影响因素的细化分析，对影响因素进行详细记录，归纳总结，并通过技术手段对这种影响因素进行量化，将有助于样本库正确流程的不断改进。

[1] Chen SL, Cheng ZM. Prior to analysis factors can not be ignored in the test quality. J Lab Med Clin Sci, 2005, 2(1):32-33. (in Chinese) 陈仕林, 程子敏. 检验质量中不容忽视的分析前因素. 检验医学与临床, 2005, 2(1):32-33.

[2] Ma Y, Dai H, Kong X. Impact of warm ischemia on gene expression analysis in surgically removed biosamples. Anal Biochem, 2012, 423(2):229-235.

[3] Betsou F, Lehmann S, Ashton G, et al. Standard preanalytical coding for biospecimens: defining the sample PRE analytical code. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2010, 19(4):1004-1011.

[4] International Society for Biological and Environmental Repositories. 2012 best practices for repositories - collection, storage, retrieval, and distribution of biological materials for research. Biopreservation Biobanking, 2012, 10(2):79-161.

[5] Australian Biospecimen Network. Australian Biospecimen Network biorepository protocols. (2007-03) [2012-10-12]. http://www.abrn.net/ protocols.htm.

[6] Xi JF. How to do a good job of quality management in the clinical laboratory analysis. Contemp Med, 2009, 15(30):94-95. (in Chinese) 奚锦芳. 如何做好临床实验室分析前质量管理. 当代医学, 2009, 15(30):94-95.