代谢组学在中药质量与药效研究中的应用

谭小燕，王毅，黄静

(1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 万州 404120； 2.四川大学 华西药学院，四川 成都 610041；3.西南交通大学，四川 成都 610031)

代谢组学在中药质量与药效研究中的应用

谭小燕1，2，王毅1，3，黄静2*

(1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 万州 404120； 2.四川大学 华西药学院，四川 成都 610041；3.西南交通大学，四川 成都 610031)

代谢组学是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，着重研究生物整体、器官或组织的内源性代谢物质的代谢途径及其所受内在或外在因素的影响及随时间变化的规律。随着发展，代谢组学在药物研发、中药研究与评价、临床诊断、毒理学研究、微生物与植物、营养科学等领域中的应用越来越广泛。本文主要综述代谢组学的研究手段与方法在中药质量控制研究和中药药效研究中的应用状况，并展望其在中医药研究领域的应用前景。

代谢组学；中药；质量控制；药效研究；模式识别

代谢组学(metabonomics)的概念由英国帝国理工学院Jeremy K Nicholson教授基于长期对生物体液的研究于1999年提出，定量测量生物系统对病生理刺激和基因修改所做的与时间相关的多参数代谢应答[1]。实际最早来源于20世纪70年代由Devaux等人提出的代谢轮廓分析(metabolic profiling)[2]。20世纪90年代后期，Oliver Fiehn在植物代谢分析的基础上提出了代谢组学(metabolomics)的概念，之后很多植物化学家开展了这方面的研究[3-4]。目前国际上形成了metabolomics和metabonomics两大代谢组学主流领域。一般认为，metabolomics是通过定性和定量地分析生物体内所有代谢物组成来研究生物代谢途径的一种技术，而metabonomics研究的是生物体在病理生理刺激或基因修饰下其所有代谢物质在不同时间的动态变化规律。前者一般以细胞为研究对象，后者更注重动物的体液和组织。

我国拥有丰富的中药资源，有药用植物11 146种，药用动物1 581种和药用矿物80种[5]。中药产业是我国的传统产业，中医中药理论无论是在诊断、药理或者毒理方面都凝聚着历史的智慧。但是中药却一直在国际上得不到肯定，关键在于中药材及其中药产品的“安全、有效、稳定、可控”问题的解决难度大，其原因主要在中药本身成分的复杂性和中药与人体作用的复杂性。中药材、中药饮片、中药复方及中成药等的质量直接影响临床疗效，而中药材的质量却是中药质量控制关键的第一步。中药材的质量好坏与所含化学成分直接相关，目前对中药组成成分的系统性测定和控制是中药材质量控制的薄弱环节。中药的多组分实质就是药用植物的多种代谢产物的集合，其组成、含量和存在状态等受产地、气候、采集季节及后处理等多方面因素的影响。代谢组学不但可以用于分析中药中各种组分的类型、含量和状态随各种因素和时间的变化，还可以定量地对其进行评价，从而实现对其质量的控制。

中药及其复方的有效性没有被国际医药主流市场所接受，其根本原因是中药理论未被国际广泛接受。目前中药尤其是复方药效的评价主要采用化学药药理评价方法，难以体现中药作用的特点和优势。中药发挥药效简单讲就是中药的化学组分相互作用，这些化学组分再与人体作用，调节、改善或刺激人体产生不同的代谢产物，从而出现防病、治病、无效或产生毒性等系列表征的过程。代谢组学的核心思想是通过内源性代谢物的变化来观测中药对机体所产生的整体效应，其思想具有与中医理论整体观念相一致的特点，并可根据代谢物组图谱的变化，发现生物标志物，阐明中药的整体效应，包括协同作用等。所以将代谢组学的方法应用到中药药效评价研究中具有重要意义。

1 代谢组学的研究手段与方法

代谢组学研究的特征是设法分析尽可能多的代谢组分。其研究一般包括样品采集和制备、代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标志物识别和途径分析等步骤[6]。生物样品可以是植物的提取物、尿液、血液、组织、细胞和培养液等，采集后首先进行生物反应灭活、预处理；然后运用核磁共振、质谱或色谱等仪器检测其中代谢物的种类、含量、状态及其变化，得到代谢轮廓或代谢指纹；而后使用多变量数据分析方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘，采用模式识别法如主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)等，识别出有显著变化的代谢标志物，并研究所涉及的代谢途径和变化规律，以阐述生物体对相应刺激的响应机制，达到分型和发现生物标志物的目的[6-7]。

2 代谢组学在中药质量研究中的应用

我国有药用植物近12 000种，中药资源在不到20年的时间里已经锐减至6 000余种，400种常用药材中有20%以上已处于短缺状态。市场上的“道地药材”多是“有其名、无其实”，还有相当一部分中药材由野生改为人工繁育后，其产品质量发生了量或质的改变。为确保中药资源的数量和质量，已经建立了上百个中药材规范化种植基地，但其质量控制缺乏科学的手段。生物的个体特征除决定于先天遗传因素外，还要受其存在环境的诸多影响，这些内外因素决定了生物个体的总体特征——代谢表型。对植物药野生株和人工繁育株的代谢表型、不同外界环境影响下的活性化合物代谢途径和相关代谢网络进行系统的研究，将有利于解决遗传育种和品质改良中效率低下、目标模糊等问题。应用代谢组学技术研究中药种质资源代谢表型，将为中药资源的可持续发展和利用提供科学依据和保障。

现阶段，我国中药材及中药制剂的质量主要依据《中国药典》2010年版一部规定的常规方法进行控制，包括性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别、薄层色谱鉴别等，对多种中药或制剂采用单指标或多指标的化学成分的测定来控制质量。虽然这种把已知的主要成分或有效成分作为指标予以检测控制的方法比过去有很大的突破和进步，但从中医药的观点来看，指标成分的控制难以真正控制中药的功效。对于在中医理论指导下的中药，尤其是复方制剂，检测任何一种活性成分均不能反映其所体现的整体疗效，分析越细，目标越缩小，离中药的整体疗效距离越远。中医辨证施治用的是药味而非某个化学成分，麻黄素与麻黄、甘草酸与甘草、人参皂苷与人参对中医来说完全是两回事。又如黄连和黄柏均含小檗碱，但测定小檗碱的含量说明不了中医用药的不同，中医也绝不会将两者相互替用；六味地黄丸中鉴别熊果酸含量不能证明里面有山茱萸，倘以山楂投料也可鉴别出熊果酸且绝对合格。可见中药的功效是中药饮片、中成药方剂内含物质群的整体作用结果，只针对某一两个化学成分，显然远远不够[8]。在这种情况下，采用代谢组学的方法最大限度地从中药中获取有关化学成分的信息，从整体上评价中药的质量成为研究趋势。

近年来，由于分析技术突飞猛进的发展，从常用的紫外、红外等光谱技术到色谱及其联用技术、核磁共振等都得到了充分的应用；数据处理技术也相应地从直观数据比较发展到了基于计算机软件的模式识别技术。代谢组学在中药鉴别和质量研究中的应用越来越广泛，在中药材、中药饮片以及各种类型的中药制剂的质量控制中纷纷采用。

Hyung-Kyoon等[9]用1H-NMR对野生型和过表达水杨酸合成基因的转基因烟草(Nicotianatabacum)的叶片和叶脉进行了研究，利用主成分分析方法得到NMR图谱，仅通过两个主成分就对样品达到了明确的鉴别。此实验提供了一种有效的不需过多步预处理程序的区分野生和转基因植物的方法。

Kim等[10]对3种麻黄植物Ephedra进行了1H-NMR指纹图谱分析，通过主成分分析找到了它们之间的代谢物差异，证明了NMR指纹图谱分析是植物化学分类学的一个有力工具，从而对中药材的鉴别提供了一条新的思路，并为其实现质量的全面控制带来了可能。

王丽等针对沙棘属植物的3个种5个亚种的21个样品，以1H-NMR获得总提物的全成分谱，再采用主成分分析和聚类分析方法，对不同种和不同亚种样品进行了种间分析，对同一亚种样品进行了种内分析。结果显示：不同种样品可以得到完全区分，同一亚种样品具有很好的整体相似度，分析结果与植物分类学基本一致。此外，通过载荷图发现不同含量的黄酮是引起鉴别的主要化学成分。该方法丰富了沙棘属的植物分类学内容，提供了一种新的质量控制手段[11]。

谭小燕等[12-13]以1H-NMR技术测定不同产地的麦冬和4个不同基原种的川贝母的全成分信息，并采用模式识别法中的PCA、PLS-DA和聚类分析法进行识别分析，能有效地鉴别出各不同产地的麦冬样本和不同基原种的川贝母，还建立了基原种预测模型。田祥琴等[14]在测定中药复方制剂洁尔阴洗液1H-NMR指纹图谱的基础上，采用模式识别法中的PCA、PLS-DA和聚类分析法，分析图谱，对2005～2007年各个批次的洁尔阴洗液样品进行分析，建立了一种全面合理控制洁尔阴洗液产品质量的新方法。罗乔奇等采用1H-NMR采集不同道地产区川白芷样品的信息，用模式识别中的主成分分析法分析不同川白芷样品的数据，结果不同产地川白芷样本间存在微小的差异，但总体趋于一致。其中，以遂宁地区所产川白芷样品的变化最小，稳定性最好，分析结果与公认的川白芷的道地性相吻合。说明1H-NMR-PR分析方法可客观、快速、有效地鉴别川白芷的道地性，也可为其他中药材的道地性分析提供参考[15]。罗乔奇等[16]还采用1H-NMR-PCA法对川白芷硫熏样本和非硫熏样本进行了分析比较，发现差异明显，并建立了PCA主成分预测模型用于鉴别川白芷伪劣样本。

由于产地、采集时间以及加工方法的不同，加上环境污染等因素，中药及许多植物药在质量上可能存在很大差异。采用代谢组学这一系统生物学技术来提高中药的质量控制水平，可为中药的质量控制提供科学的依据。FIEHN O在植物代谢组学方面做了大量的研究[17]。有研究者用代谢组学的方法研究气候等生长环境对中药化学成分谱的影响，同时研究其质量控制方法[18]。中药质量控制方面，代谢组学在中药指纹图谱朝着综合、整体方向发展的基础上又有了新的发展。

3 代谢组学在中药药效研究中的应用

中药所含成分的复杂性使得其治疗作用也是一种多系统、多靶点、多层次的作用，具有整体、综合、动态及多样性的特点，即这些化合物之间也有“君臣佐使”相互协同的作用关系，如何将中医的独特疗效转化为有效证据，阐明这种复杂的作用机制是中药研究的一个难点和重要任务。对于中医药来说，首先要证明有效。然而，在什么方面有效、有效的标准如何确定，是当前中医药走向世界最需解决的问题，而中药的“质量控制”技术也必须与“药效的优劣”相联系才有意义。许多研究者长期使用化学药的指标评价体系来衡量中药的疗效，以此来表明中药的有效性和科学性，然而由于中药的特殊性使得采用这一体系出现诸多问题。如：中药作用的温和性和多靶点性使得中药很可能在单一的关键药效指标上无法与化学药相比，如果由此认为中药无疗效或疗效不好，就忽视了中药的整体性，对中药很不公平。如今，医药工作者试图建立符合中医中药特色的药效评价体系。

伴随生命科学的发展，特别是系统生物学的出现，使得生命科学进入整合性研究时期。代谢组学是研究生命网络重要组成部分代谢物的一门学科，代谢处于生命活动调控的末端，比基因组学、蛋白质组学更接近表型。中药作用生命网络的不同层次、不同靶点都会引起与之相关的一系列代谢物在浓度及相对组成上发生变化，通过现代分析手段测定这些相互关联的变化，可以从整体上把握中药的作用特点，进而通过代谢物的变化追溯到相关的蛋白质及基因表达的变化，从更高层次上阐明中药的作用机制。

中药进入人体发挥作用的基本环节是药物分子与细胞之间各种组分的直接或间接的相互作用。中药化学成分复杂，单味药材就有很多个化学成分，更何况中药复方，其复杂性和整体性决定了确定其有效成分的难度。但从机体的角度来看，机体本身是一个极其复杂的巨大系统，每个系统中都包含着多因素的问题。疾病的发生大多数也是通过多种途径导致整体功能紊乱的过程，中药有效成分进入人体进而发挥多成分、多靶点、多途径的作用，必然会引起整个生命网络从遗传信息到整体功能实现中的分子、细胞、器官、整体多个层面的结构与功能状态变化，这些变化会体现在相关代谢物在量上的改变。因此，可以内源性代谢物表达为指标进行中药复方有效成分多组分、多环节、多靶点治疗调整作用的研究。采用代谢组学来研究中药的药效是一个新生事物，也是一种发展趋势。

至今将代谢组学用于中药药效研究的例子很多。如：天津药物研究院[19]在研究参麦注射液的作用物质基础时，发现该中药能够激发机体形成洋地黄样的多肽物质，发挥洋地黄样物质作用，是缓解心衰的物质基础。Solanky等对10只SD大鼠给予22 mg剂量的表儿茶酸，并收集给药前后大鼠的尿样，采用基于NMR技术的代谢组学技术平台，并结合主成分分析的数据处理方法研究了表儿茶酸(一种类黄酮)对大鼠生化代谢的影响。研究表明，给药后大鼠尿液中牛磺酸、柠檬酸盐及二甲胺等内源性代谢物的浓度降低。对给药后不同时段收集的尿液进行分析，表明给药后8 h对代谢的影响明显，而且表儿茶酸对生化代谢的影响是可逆的。这一研究结果表明，代谢组学技术可以检测到天然产物对生命体新陈代谢的影响，虽然表儿茶酸是一个来源于天然植物的单一化合物，但此方法可用于中药药效研究[20]。Wang等采用代谢组学的方法研究了甘菊对人体生化代谢影响，采用高分辨NMR技术集合模式识别方法，进行了为期6周的研究，对志愿者分别收集给药前、给药期间及给药后的各两周的每日尿样。结果显示，给药前尿样与给药期间尿样中内源性代谢物的含量有比较大的差别；代谢轨迹分析表明，甘菊对人体生化代谢有比较持久的影响，停止给药后，药效依然持续了很长一段时间。这一研究结果表明，虽然环境因素及志愿者个体差异较大，代谢组学的方法依然能够有效地评估甘菊这种含有多种成分的复杂体系对人体生化代谢的影响[21]。谭小燕等[22]基于代谢组学的方法开展了黄连解毒汤治疗氨基半乳糖(D-Galn)诱导的急性肝损伤大鼠的药效学评价方法研究，不同时间段采集模型组、正常组和给药组的血液样本，通过1H-NMR技术采集提取信息，再通过主成分分析等手段进行模式识别研究，发现正常组与模型组的血清样本呈明显差异，在分析图上呈明显两大区域，而给药组随着给药时间的延长，呈现由模型组区域向正常组靠近的明显趋势。由此可见，对于黄连解毒汤药效的评价，尽管暂时无法说明是什么物质或成分起了作用，但可以初步确定其具有疗效，此探索将是用于中药及复方筛选的一个新思路与方向。李云士还联合天津急腹症研究所利用代谢组学方法与技术，采用双盲法进行了两种中药复方治疗脓毒症的药效评价，结果与临床长期观察使用结果一致。这次试验对代谢组学方法用于中药及其复方的药效评价、新药研发初步筛选具有重要意义[23]。

4 小结与展望

代谢组学是新药研究开发的重要组成部分，其应用涵盖了新生物标志物的发现、新药筛选、安全性实验等[24]。运用具有反映整体思想的、先进的代谢组学方法来研究中药，对控制中药质量，搞清中药的物质基础、作用机理、作用靶标、药效作用、组方依据、配伍规律和毒副作用以及对中药种质资源等进行研究，是十分必要的，它有可能使有着几千年历史、以经验为基础的中药治病向以科学方法和标准为基础的现代化中药治病转变，从而对中医药事业的长远和健康发展产生十分深远的积极影响。

目前，代谢组学研究的主要困难在于样品和研究对象的复杂、多样和多变性。当前代谢组学研究的局限性主要体现在几个方面：①缺少“全能型”分析技术。对某一物种、某个组织或其细胞中所有的代谢途径中的所有代谢产物同时进行全面的高通量的定性和定量分析，在理论上行得通，但尚没有任何一种分析技术能够同时对代谢组中的所有化合物进行分析。②缺少功能完善的代谢产物数据库和相应代谢物组数据的标准值。③非实验性因素干扰研究结果。各种生理因素，如饮食、健康状态、年龄、昼夜节律、压力、遗传变异和动物品系均可影响生物标本的代谢成分，为分析结果带来难度。除严格控制实验条件外，还需要寻找更加灵敏的检测手段和深入的数据分析方法。④生物标志物的结构鉴定难。如何从大量的代谢产物中找出特异性的生物标志物，决定了其能否在临床领域广泛应用。⑤检测所需的仪器设备价格昂贵，操作人员的专业性强，也限制了这一技术的推广。随着科学技术的进步，技术平台要以开发联用技术为核心，并不断发展和完善适合不同分析目的的样品前处理、数据信息提取和模式识别系统，结合化学计量学和生物信息学，经过坚持不懈的努力，逐步建立并完善代谢组学研究技术平台。

代谢组学在中医药研究领域应着手开展几方面研究：①研究植物源中药种质资源代谢表型；②评价单味中药安全性；③研究常用复方中药配伍的科学性；④建立中药代谢数据信息库。由于代谢组学研究的自身复杂性，整体上仍处于初期发展阶段，还需要进一步在技术体系和研究思路上进行创新和突破。但随着科技进步，健康观念、医学模式、医疗模式的全面转变，个体化诊疗、个体化用药以及亚健康、慢性非传染性疾病的防治成为医学研究的重点。采用代谢组学相关技术与方法进行中医药研究，用现代术语阐释中医“因人制宜”、“治未病”等独特的思维方式和治疗方法，将为中医药的现代化和国际化发展开辟新的方向。

[1] Nicholson JK，Lindon JC，Holmes E.‘Metabonomics’：understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimulivia multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica，1999，29 (11)：1181-1189.

[2] Li F M，Wang D W，Jiang Z M，et al.Activity stimulating osteoblast-like cells proliferation of some traditional Chinese medicinal drugs and other plants[J].Pharm Biol，2001，39 (5)：351-356.

[3] Devaux P G，Horning M G，Hill R M，et al.O-benzyloximes：derivatives for the study of ketosteroids by gas chromatography.Application to urinary steroids of the newborn human[J].Anal Biochem，1971，41(1)：70-82.

[4] Taylor J，King R D，Altmann T，et al.Application of metabolomics to plant genotype discrimination using statistics and machine learning[J].Bioinformatics，2002，18 (Suppl 2)：S241-248.

[5] Fiehn O.Metabolomics-the link between genotypes and phenotypes[J].Plant Mol Biol，2002，48(1-2)：155-171.

[6] Teresa Whei-Mei Fan, Andrew N Lane, Richard M Higashi. The Handbook of Metabolomics[M]. Totowa: Humana Press, 2012:291.

[7] 许国旺，路鑫，杨胜利.代谢组学研究进展[J].中国医学科学院学报，2007，29(6)：701.

[8] 谢培山.色谱指纹图谱分析是中草药质量控制的可行策略[J].中药新药与临床药理，2001，12(3)：14.

[9] Hyung-Kyoon Choi，Young Hae Choi，Marianne Verberne，et al.Metabolic fingerprinting of wild type and transgenic tobacco plants by1H NMR and multivariate analysis technique[J].Phytochemistry，2004，65(7)：857-864.

[10] Kim H K，Choi Y H，Erkelens C，et al.Metabolic finger PrintingofEphedraspecies using1H-NMR spectroscopy and principalcomponent analysis[J].Chem Pharm Bull，2005，53(1)：105.

[11] 王丽.沙棘的氢核磁共振指纹图谱研究[D].成都：四川大学，2007.

[12] 谭小燕，罗乔奇，黄静，等.不同产地麦冬1H-NMR模式识别研究[J].中草药，2009，40(5)：5.

[13] 谭小燕，张艺，肖云川，等.1H-NMR-PR研究4种基源种川贝母的整体差异性[J].华西药学杂志，2011，6(4)：516-519.

[14] 田祥琴.洁尔阴洗液氢核磁共振-模式识别研究[D].成都：四川大学，2008.

[15] 罗乔奇，肖云川，席珍，等.1H-NMR-PR分析川白芷的道地性[J].华西药学杂志，2011，26(4)：513-515.

[16] 罗乔奇，肖云川，席珍，等.川白芷硫熏的1HNMR-PCA鉴别预测模型的研究[J].华西药学杂志，2011，26(6)：432-434.

[17] FIEHN O.Metabolic networks of Cucurbita maxima phloem[J].Phytochemistry，2003，62 (6)：875-886.

[18] Chang W T，Thissen U，Ehl Ert Ka，et al.Effects of growth conditions and processing on Rehmannia glutinosa using fingerprint strategy[J].Planta Med，2006，72(5)：458-467.

[19] 刘昌孝.代谢物组学在中药现代研究中的意义[J].中草药，35(6)：601-609.

[20] Solanky K S, Bailey N J, Holmes E,et al. NMR-based metabonomic studies on the biochemical effects of epicatechin in the rat[J]. J Agric Food Chem, 2003, 51(14):4139-4145.

[21] Wang Y, Tang H, Nicholson J K, et al. A Metabonomic Strategy for the Detection of the Metabolic Effects of Chamomile(MatricariarecutitaL.)Ingestion[J]. J Agric Food Chem, 2005, 53(2): 191.

[22] 郭尹玲，扈晓宇，谭小燕，等.附子对免疫性肝损伤模型大鼠的影响及代谢组学研究[J].西部医学，2010，22(5)：797-799.

[23] 李云志.基于代谢组学的中药复方治疗脓毒症模型大鼠药效学评价方法初步研究[D].成都：四川大学，2009.

[24] 贾伟.医学代谢组学[M].上海：上海科学技术出版社，2011.

TheApplicationofMetabolomicsinResearchofTraditionalChineseMedicineQualityandPharmacodynamics

TAN Xiao-yan1，2，WANG Yi1，3，HUANG Jing2*

(1.ChongqingThreeGorgesMedicalCollege，Wanzhou404120，China;2.WestChinaSchoolofPharmacySichuanUniversity，Chengdu610041，China;3.SouthwestJiaotongUniversity，Chengdu610031，China)

Metabolomics is an emerging discipline which developed in the end of the 1990s.It focuses on biological overall organ or tissue metabolic pathways of endogenous metabolites，the rules of changes caused by internal or external factors.With the technology development，metabolomics is more and more widely used in drug research，Traditional Chinese Medicine research and evaluation，clinical diagnostics，toxicology studies，microorganisms and plants，nutrition science.This article reviews the application status of metabolomics research tools and methods in the study of Traditional Chinese Medicine quality control and pharmacodynamics，and the prospects of their application in Traditional Chinese Medicine.

Metabolomics；Traditional Chinese Medicine；Quality control；Pharmacodynamics research；Pattern recognition(PR)

2013-06-18)

*

黄静，教授，博士生导师，研究方向：天然药物(中药)生物活性成分、体内吸收代谢的NMR分析研究；Tel：(028)85503045，E-mail：huangj_pharm@scu.edu.cn