鼻脑通鼻用喷雾剂对实验性偏头痛动物ET-1、CGRP含量的影响△

侯虹丽，孙芳玲，咸明慧，赵润怀，肖苏萍，蒋莹，艾厚喜，张丽，王文*

(1.首都医科大学 宣武医院，北京 100053； 2.北京祈福瑞草医药科技有限公司，北京 100094；3.中国药材公司，北京 100195)

鼻脑通鼻用喷雾剂对实验性偏头痛动物ET-1、CGRP含量的影响△

侯虹丽1，孙芳玲1，咸明慧2，赵润怀3，肖苏萍3，蒋莹1，艾厚喜1，张丽1，王文1*

(1.首都医科大学 宣武医院，北京 100053； 2.北京祈福瑞草医药科技有限公司，北京 100094；3.中国药材公司，北京 100195)

目的：研究鼻脑通鼻用喷雾剂对实验性偏头痛小鼠内皮素-1(ET-1)、降钙素基因相关肽(CGRP)含量的影响。方法：75只ICR小鼠，雌雄各半，随机分为5组，即对照组、模型组、鼻脑通鼻用喷雾剂低、中、高剂量组，每组15只。采用硝酸甘油皮下注射制备小鼠实验性偏头痛模型，造模后20 min开始记录小鼠前肢搔头的次数，记录10 min；造模4 h后腹主动脉取血，测定血浆中ET-1、CGRP指标。结果：与对照组相比，模型组动物搔头次数显著增多(P<0.001)；提前给予鼻脑通鼻用喷雾剂3个剂量后，造模小鼠的搔头次数均比模型组显著减少(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。与对照组相比，模型组动物血浆ET-1含量显著升高(P<0.001)、CGRP含量升高(P<0.01)；而与模型组相比，提前给予鼻脑通鼻用喷雾剂3个剂量后，造模的动物血浆中、高剂量组ET-1含量显著降低(P<0.001，P<0.001)，低、中、高剂量组CGRP含量均降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。结论：鼻脑通鼻用喷雾剂能减少实验性偏头痛动物的搔头次数，其治疗偏头痛的机制可能与降低动物血浆ET-1、CGRP含量有关。

鼻脑通鼻用喷雾剂；实验性偏头痛小鼠；搔头次数；ET-1；CGRP

偏头痛是一种临床常见的慢性血管神经性疾病，严重影响人类生存质量。虽然现代临床有多种学说，但其发病机制尚不明确，治疗较易反复，给患者带来较大精神压力。目前临床治疗多选用化学药，如麦角胺制剂、5-HT1B/1D受体激动剂、抗精神病类药等，虽然起效快，但存在禁忌症较多、价格昂贵、不良反应及毒副作用大等不足。因此，从长远治疗效果来看，药性平和、不良反应小的中药治疗偏头痛效果更持久，值得深思和探讨。

鼻脑通鼻用喷雾剂是根据中医“脑窍通于鼻”、“纳鼻而通十二经”的理论和现代医学鼻黏膜吸收原理研发的鼻用喷雾剂，集川芎、大果木姜子、莱菔子、冰片、人工麝香等辛温活血、通窍止痛的中药组方，经大果木姜子、莱菔子、川芎提取挥发油后，药渣加水提取、浓缩、醇沉、静置，回收乙醇至无醇味，浸膏备用；人工麝香乙醇超声提取，水提；冰片乙醇溶解液与挥发油、人工麝香醇提取液以羟丙基-β-环糊精包合；各液混合后加羟苯乙酯和水，调整至一定体积，灌装而成。动物药效、毒理试验研究和药物稳定性研究证明，本药具有速效止痛的药效，无明显毒副作用，且质量稳定可控，目前已获得国家药物临床试验批件。实验通过观察鼻脑通鼻用喷雾剂对硝酸甘油偏头痛小鼠模型搔头次数及血浆中内皮素-1(ET-1)、降钙素基因相关肽(CGRP)水平的影响，以探讨鼻脑通鼻用喷雾剂对偏头痛的影响及可能机制，为寻找预防和治疗偏头痛的有效药物提供依据。

1 材料

1.1 实验动物

ICR种小鼠75只，雌雄各半，体重18～22 g。由北京大学医学部实验动物科学部提供，合格证号：SCXK(京)2011-0012。

1.2 药品与试剂

鼻脑通鼻用喷雾剂(中国药材公司，规格：0.8 mg·mL-1，即1mL溶液中含有0.8 mg生药量)。

硝酸甘油注射液(北京益民药业有限公司，1 mL∶5 mg，批号：20130317)，ET-1试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：LOT M20130328，生产日期：20130328)。CGRP试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：LOT M20130328，生产日期：20130328)。

1.3 仪器

R-320低温高速离心机(北京白洋医用离心机有限责任公司)，Thermofisher Multiskan Spectrum全波长酶标仪。

2 方法

2.1 动物分组及给药剂量

取受试小鼠75只，按体重随机分成5组，即对照组，模型组，鼻脑通鼻用喷雾剂低、中、高剂量组，每组15只。给药组动物鼻腔给予鼻脑通鼻用喷雾剂低剂量(0.1 g生药·kg-1)、中剂量(0.2 g生药·kg-1)、高剂量(0.4 g生药·kg-1)，1次/天，连续给药3 d。对照组和模型组鼻腔给予同体积蒸馏水。

2.2 偏头痛模型的复制方法

各组动物末次给药后30 min，模型组和各给药组皮下注射硝酸甘油5 mg·kg-1，空白对照组给予等体积的0.9%氯化钠溶液。

2.3 小鼠前肢搔头次数的行为学监测

造模20 min后，动物出现双耳发红、前肢频繁搔头、爬笼次数增多、烦躁不安现象，此现象持续约3 h，继而出现蜷卧、活动减少状态。因此，造模后20 min开始记录10 min内小鼠前肢搔头的次数。

2.4 标本处理及ET-1、CGRP含量的测定

造模后4 h，0.4 mL·(100 g)-1水合氯醛麻醉动物，经腹主动脉穿刺取血3 mL，注入抗凝管中，轻轻摇匀静置。4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min，分离血浆，按编号放入低温冰箱中-20 ℃贮存备用。按照ET-1、CGRP试剂盒说明，采用酶联免疫吸附法测定血浆ET-1、CGRP含量。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 鼻脑通鼻用喷雾剂对偏头痛模型小鼠搔头次数的影响

结果表明，与对照组比较，模型组小鼠搔头次数明显增多(P<0.001)。而提前给予鼻脑通鼻用喷雾剂后，低、中、高3个给药剂量的小鼠搔头次数均比模型组显著减少(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，表明鼻脑通鼻用喷雾剂能减少实验性偏头痛小鼠搔头次数，见表1。

表1 鼻脑通鼻用喷雾剂对实验性偏头痛小鼠搔头次数的影响

注：与对照组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；下同

3.2 鼻脑通鼻用喷雾剂对模型小鼠血浆ET-1含量的影响

各组小鼠血浆ET-1含量对比见图1。与对照组相比，模型组小鼠血浆ET-1含量明显升高(P<0.001)。给药组(中、高剂量)小鼠血浆ET-1含量比模型组显著降低(P<0.001，P<0.001)，表明鼻脑通鼻用喷雾剂能降低实验性偏头痛小鼠血浆ET-1含量。

图1 鼻脑通鼻用喷雾剂各剂量组及对照组、模型组 小鼠血浆ET-1含量对比

3.3 鼻脑通鼻用喷雾剂对模型小鼠血浆CGRP含量的影响

各组小鼠血浆CGRP含量对比见图2。实验性偏头痛模型组小鼠血浆CGRP含量比对照组明显升高(P<0.01)。各给药组小鼠血浆CGRP含量比模型组含量显著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，表明鼻脑通鼻用喷雾剂能降低实验性偏头痛小鼠血浆CGRP含量。

注：与对照组比较，## P<0.01 图2 鼻脑通鼻用喷雾剂各剂量组及对照组、模型组 小鼠血浆CGRP含量对比

4 讨论

偏头痛发病机制复杂，至今尚未完全阐明，主要有5-HT、皮层扩布性抑制、三叉神经血管反射学说等机制。其中三叉神经血管反射学说被认为是偏头痛发病机制的主流学说[1-3]。在偏头痛发作期，颅内脑外血管扩张，血管周围神经释放血管活性肽，如：降钙素基因相关肽(CGRP)、内皮素(ET)、P物质(SP)等引起神经源性炎症并释放许多炎性细胞因子，以及中枢痛觉传导的抑制降低，将神经、血管、递质三者相结合，比较全面地解释了偏头痛的发病机制。

在正常生理情况下，ET和CGRP处于动态平衡状态，维持着脑血管的舒缩功能，调节血管弹性，对维持血管外周压力和局部血管舒缩功能具有重要意义。研究表明[4-6]，偏头痛发作期患者血浆中血管活性物质CGRP、ET含量异常，颅内血管舒缩功能失衡。ET为强烈的脑动脉收缩剂，正常生理状态下，ET合成释放很低，偏头痛发作时ET释放增加，引发皮层扩布性抑制，ET通过血管平滑肌细胞膜上的受体与靶细胞膜结合，激活鸟苷酸环化酶、磷酸肌醇系统和Ca2+通道，增高细胞质中Ca2+浓度而影响血管张力，触发偏头痛[1]。CGRP为强烈的血管舒张剂，偏头痛发作时激活三叉神经血管系统，结果使CGRP释放增加。有研究显示[7]，偏头痛患者血浆CGRP水平升高，使用CGRP受体拮抗剂可显著减轻偏头痛的发作。

硝酸甘油皮下注射实验性偏头痛动物模型是一个公认的偏头痛模型。造模后动物行为症状学表现与人有一定的相似性，是用于研究人类偏头痛发病机制及生物学等变化的理想选择[8]。冯玥等[9]研究显示，采用硝酸甘油造模后，血浆中CGRP、ET含量明显升高；宁式颖等[10]造模后，给予首舒康颗粒，血管活性物质如CGRP增加受到抑制，从而抑制脑血管异常扩张，抑制血浆外渗、血小板活化等所导致的神经源性炎症，从而缓解偏头痛。

实验结果显示，硝酸甘油诱导的偏头痛小鼠搔头次数较对照组明显增加，血浆ET-1、CGRP水平也明显升高；鼻脑通鼻用喷雾剂进行干预后，偏头痛小鼠搔头次数显著减少，血浆两项指标也明显降低，提示鼻脑通鼻用喷雾剂通过改善血管舒缩功能来预防偏头痛的可能机制。依据偏头痛的具体机制进行药物开发曾一度被认为是遥不可及的，随着对偏头痛神经生物学机制的研究深入，CGRP受体拮抗剂、前列腺类受体拮抗剂、离子通道拮抗剂等肽类受体拮抗剂已成为治疗偏头痛药物开发的新靶标[11-12]。鼻脑通鼻用喷雾剂能显著降低实验性偏头痛动物血浆CGRP含量，具体机制还需进一步研究。

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[2] 姜艳艳，金永华.CGRP及其受体在偏头痛发病机制中的研究[J].中风与神经疾病杂志，2012，29(5)：479-480.

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EffectsofBinaotongNasalSprayonET-1andCGRPLevelsinExperimentalMicewithMigraine

HOU Hong-li1，SUN Fang-ling1，XIAN Ming-hui2，ZHAO Run-huai3，XIAO Su-ping3， JIANG Ying1，AI Hou-xi1，ZHANG Li1，WANG Wen1*

(1.XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China； 2.BeijingQifuruicaoPharm-TechCo.，Ltd.，Beijing100094，China； 3.ChinaNationalCorp.ofTraditional&HerbalMedicine，Beijing100195，China)

Objective：To study the effects of binaotong nasal spray on ET-1 and CGRP levels in experimental mice with migraine.Methods：75 ICR mice were randomly divided into 5 groups(n=15)：control group，model group，binaotong nasal spray groups of low dose，middle dose and high dose.Experimental model of migraine mice was performed by hypodermic injection of nitroglycerin.20 min later，the frequency of scratching head was record for 10 min.The plasma ET-1、CGRP levels were detected respectively 4 h later.Results：The frequency of scratching head in model group was increased significantly compared with control group(P<0.001).However，treatment of binaotong nasal spray at three concentrations reduced the frequency of scratching head(P<0.05，P<0.01，P< 0.001).In nitroglycerin-induced migraine model mice，plasma ET-1 level was increased significantly(P<0.001)and plasma CGRP level was increased(P<0.01)compared with control group.However，plasma ET-1 levels were decreased markedly in binaotong nasal spray-treated groups of middle dose and high dose(P<0.001，P<0.001)，plasma CGRP levels were decreased(P<0.05，P<0.01，P<0.01).Conclusion：Binaotong nasal spray could decrease the frequency of scratching head in experimental migraine mice.Furthermore，its mechanisms may be decreaseing plasma ET-1 and CGRP level

Binaotong nasal spray；Experimental migraine mice；Frequency of scratching head；ET-1；CGRP

2013-07-04)

“重大新药创制”科技重大专项(2011ZX09102-003-05)

*

王文，教授，博士生导师，研究方向：神经药理，中药药理；Tel：(010)83198881，E-mail：lzwwang@163.com