硫磺熏制对杭白菊总黄酮含量的影响

徐莉莉 浙江省金华市金东区中医院中药房 金华 321031

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硫磺熏制对杭白菊总黄酮含量的影响

徐莉莉 浙江省金华市金东区中医院中药房 金华 321031

杭白菊 硫磺熏制 总黄酮

杭白菊又称杭菊，是菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序，为《中国药典》所收载[1]，是著名的“浙八味”之一，具有散风清热，平肝明目、清热解毒功效，用于风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒等症，是临床常用中药。菊花的主要有效成分为黄酮、三萜、挥发油等[2]，菊花总黄酮具有抗氧化[3-4]、降血压、扩张冠状动脉[5-7]等作用，是杭白菊主要药效物质，具有较大的药用和保健价值。

硫磺熏蒸是一种在中药材及饮片的加工和贮藏过程中应用较为普遍的加工方法，具有干燥、防虫、防霉以及增白等作用[8]，但是由于硫磺熏蒸使杭白菊残留大量的二氧化硫，且导致有效成分的化学结构和含量发生改变[9-10]，影响杭白菊临床应用的安全性和有效性。本实验采用可见紫外分光光度法测定杭白菊硫磺熏制前后总黄酮含量，为优化杭白菊的炮制加工方法提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 试剂与药材 芦丁（中国药品生物制品检定所，批号100080-201106）；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠为分析纯。杭白菊：采集于浙江桐乡，经金华职业技术学院医学院罗国海副教授鉴定为菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的新鲜头状花序；分别采用传统蒸制干燥、一次硫磺熏制、二次硫磺熏制法制备成杭白菊干燥品，粉碎，过2号筛备用。

1.2 仪 器 VU-265FM紫外可见分光光度计（日本岛津），HH-6型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司），XP205电子分析天平（瑞士梅特勒托利多）。

2 实验方法与结果

2.1 对照品溶液和供试品溶液的制备 精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品约25mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取20mL，置50mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得（每1mL中含无水芦丁0.224mg）。取杭白菊粉末约0.5g，精密称定，置100mL圆底烧瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称重，回流提取1h，放凉，称重，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 最大吸收波长的选择 精密吸取芦丁对照品溶液和杭白菊供试品溶液各1mL，分别置于25mL量瓶中，各加入70%乙醇至6mL，分别加入5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min；加入10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min；加入1mol/L氢氧化钠溶液10mL，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，于400～600nm扫描，结果在504nm处有最大吸收。

2.3 标准曲线的制备 精密吸取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分别置于25mL容量瓶中，各加入70%乙醇至6mL，然后分别加入5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min；加入10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min；加入1mol/L氢氧化钠溶液10mL，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，立即照紫外-可见分光光度法（2010版中国药典一部附录ⅤA），于504nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得吸光度Y与芦丁浓度X的回归方程:A=9.486X+0.04，R2=0.9990。

2.4 提取工艺优选 通过预试验及相关文献研究发现，影响杭白菊总黄酮提取的主要因素有提取方法、乙醇浓度、溶剂用量和提取时间。因此，对四个因素进行单因素考察。

2.4.1 提取方法 取杭白菊粉末约0.5g，精密称定，分别置100mL圆底烧瓶中，精密加入50%乙醇50mL，称重，分别超声30min、60min，回流30min、60min，放凉，称重，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液1mL，分别置25mL量瓶中，照“2.3标准曲线的制备”项下的方法，自“加70%乙醇至6mL”起依法测定吸光度，计算，即得。结果分别为，超声30min含量为6.25%、60min为6.63%，回流30min为6.84%、60min为7.15%，结果表明，回流提取的黄酮含量高于超声提取，因此，选择回流为杭白菊总黄酮提取方法。

2.4.2 乙醇浓度考察 取杭白菊粉末约0.5g，精密称定，置100mL圆底烧瓶中，分别精密加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%浓度的乙醇50mL，称重，回流提取，放凉，称重，用相应浓度的乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照前述述方法进行测定。结果乙醇浓度在50%～80%范围内时，测得总黄酮含量较高，且乙醇浓度为70%时，测得的总黄酮含量最高，为8.36%。因此，将乙醇浓度确定70%。

2.4.3 提取时间考察 取杭白菊粉末约0.5g，精密称定，置100mL圆底烧瓶中，精密加入70%乙醇各50mL，称重，分别回流提取0.25、0.5、1和1.5h，放凉，称重，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照前述方法进行测定。结果发现随着回流时间的延长总黄酮含量增加，当回流时间大于1h时，总黄酮含量增加不明显，因此，将提取时间确定为1h。

2.4.4 溶剂用量考察 取杭白菊粉末约0.5g，精密称定，置100mL圆底烧瓶中，分别精密加入70%乙醇40、50、60和70mL，称重，分别回流提取1h，放凉，称重，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照前述方法进行测定。结果发现，当溶剂超过50 mL时，总黄酮含量变化不大。因此，确定溶剂用量为50 mL。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密吸取对照品溶液4mL，供试品溶液1mL，置于25mL量瓶中，同“2.4标准曲线的制备”项下，自“加70%乙醇至6mL”起，同法操作，测定吸光度，测定六次。对照品溶液及供试品溶液吸光度的RSD分别为0.21%和0.18%，说明精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 精密吸取芦丁对照品溶液4mL，供试品溶液1mL，置于25mL量瓶中，同“2.4标准曲线的制备”项下，自“加70%乙醇至6mL”起，同法操作，每隔10min测定一次吸光度。对照品溶液及供试品溶液吸光度的 RSD分别为 2.22%和2.39%，RSD均小于3%，结果表明对照品溶液和供试品溶液显色后在1h内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 分别取杭白菊粉末6份，照“2.2对照品溶液和供试品溶液的制备”项下供试品溶液制备方法操作，照前述含量测定方法进行测定，测得总黄酮含量平均值为8.39%，RSD值为1.36%，表明本法重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 采用加样回收法试验。取已知总黄酮含量的杭白菊0.25g，精密称定，共取6份，分别准确加入芦丁对照品适量，照“2.2对照品溶液和供试品溶液的制备”项下供试品溶液制备方法操作，制备成供试品溶液，照前述含量测定方法进行测定，计算回收率。试验结果表明，芦丁平均回收率为99.6%%（n=6），RSD为2.63%。说明测定结果准确。结果见表1。

2.6 样品测定 分别称取杭白菊传统蒸制干燥、一次硫熏、二次硫熏样品粉末三份，每份0.5g，精密称定，照“2.2对照品溶液和供试品溶液的制备”项下供试品溶液制备方法操作，照前述含量测定方法进行测定。结果见表2。

3 讨 论

通过对杭白菊总黄酮含量的测定发现，硫磺熏制与传统蒸制干燥的杭白菊相比黄酮含量有较大幅度的下降，一次熏制下降约25%，二次熏制下降接近40%。在总黄酮的含量测定中，利用Al（NO3）3溶液与黄酮络合显色，铝离子与4-羰基、5-羟基或4-羰基、3-羟基络合，在碱性条件下呈红色，在510nm左右有最大吸收。而硫熏过程中，产生的大量二氧化硫，可能与酚羟基发生反应，生成亚硫酸酯，从而难以与铝离子产生络合，可能是硫磺熏制后总黄酮检测结果大幅降低的原因。

总黄酮为杭白菊主要有效部位，具有抗氧化、降血压、扩张冠状动脉等作用，是杭菊主要药效物质。黄酮类成分一般含有酚羟基，是其发挥药理活性的重要官能团。硫熏过程中，酚羟基可能发生酯化，从而使黄酮类成分丧失相应的药理作用，降低疗效。

本试验结果提示应当限制硫磺熏蒸在杭白菊加工过程中的使用，应采用化学手段对硫磺熏制后黄酮类化学成分的变化进行确认，并对总黄酮硫熏后的毒理作用、药理活性进行考察，为确定杭白菊更合理的加工炮制方法提供科学依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：292.

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［5］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，1986：563-564.

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2013-04-12