银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝脏血小板衍生生长因子表达的影响

李婉儿 浙江老年关怀医院 杭州 310015

陈芝芸 严茂祥 蔡丹莉 姚嘉明 高晓倩 浙江省中医院

银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝脏血小板衍生生长因子表达的影响

李婉儿 浙江老年关怀医院 杭州 310015

陈芝芸 严茂祥 蔡丹莉 姚嘉明 高晓倩 浙江省中医院

目的：观察银杏叶提取物（GbE）对大鼠肝组织PDGF表达的影响。方法：采用CCL4建立大鼠肝纤维化，同时以50、100、200mg/（kg·d）的GbE干预，以复方鳖甲软肝片为对照，连续6周后取肝组织，采用RT-PCR法检测肝组织PDGFmRNA表达，免疫组化法测定肝组织PDGF蛋白的表达。结果：模型大鼠肝组织PDGFmRNA和蛋白表达较正常组明显增高（P＜0.01），GbE和复方鳖甲软肝片干预后大鼠肝组织PDGFmRNA和蛋白表达较模型组显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。结论：GbE可能通过降低肝组织PDGF的表达，抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化的进展。

大鼠 肝纤维化 银杏叶提取物 血小板衍生生长因子

肝纤维化是肝细胞外基质产生大于降解的病理过程，肝星状细胞的激活和转化是肝纤维化形成的中心环节和必要条件。血小板衍生生长因子（plate⁃let-derived growthfactor，PDGF）是肝星状细胞最强的有丝分裂原，可使其激活、增殖和分化，在多个环节上促进肝纤维化的发生、发展。笔者前期研究发现，银杏叶提取物（ginkgo biloba extract，GbE）能抑制肝星状细胞的活化，改善肝组织炎症活动程度和纤维化程度，有效防治CCl4诱导的大鼠肝纤维的进展[1-2］。本研究观察GbE对肝纤维化大鼠肝组织PDGF表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性清洁级SD大鼠60只，体质量（200±10）g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（沪）2003-0003。

1.2 主要药物和试剂 CCL4（批号050615），上海凌峰化学试剂有限公司产品；橄榄油（批号20040120），北京京都利德食品有限公司产品（西班牙百叶公司）。GbE（批号050118），西安中鑫生物技术有限公司产品，其中，含黄酮苷和银杏内酯分别为24.03%和6.15%；复方鳖甲软肝片，内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司产品（批号20051208）。Trizol，Invitro⁃gen公司产品（批号1317025）；逆转录酶MMLV（批号 21542119）、Taq酶（批号130214）、三磷酸脱氧核苷（dNTP，批号230106），Promega公司产品；寡核苷酸（Olig dT），上海博亚公司合成；标准分子量DNA marker DL2000（批号F4801），TaKaRa公司产品。引物由上海鼎安生物科技有限公司合成；PDGF-BB上游引物：5’-CCT GAG GAA CTC TAT GAA ATG C-3’，下游引物：5’ACA TTG CGG TTA TTG CAG C-3’，扩增片段341bp；GAPDH上游引物：5’-GTC GGT GTG AAC GGA TTT-3’，下游引物5’-ACT CCA CGA CAT ACT CAG C-3’，扩增片段247bp。兔抗PDGF-BB多克隆抗体（批号200608），武汉博士德生物技术有限公司产品；二步法免疫组化生物检测试剂盒PV6002（批号1360）均为北京中杉生物技术有限公司产品。

1.3 实验方法 60只大鼠随机分成正常组、模型组、复方鳖甲软肝片组、GbE低剂量组、GbE中剂量和GbE高剂量组，每组10只；正常组按3mL/kg皮下注射橄榄油，1周2次，其余各组按3mL/kg皮下注射40%CCL4（以橄榄油配制）1周2次，首次加倍，连续6周；造模同时复方鳖甲软肝片组每天灌服1g/kg的复方鳖甲软肝片，GbE低、中、高剂量组每天分别灌服GbE50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg，正常组和模型组灌服等容量蒸馏水，均连续6周；大鼠以普通大鼠饲料喂养，自由饮水。末次给药当晚大鼠禁食不禁水，次日上午空腹麻醉处死大鼠，取肝组织，取部分肝组织4%多聚甲醛固定后常规石蜡包埋待用；其余肝组织-70℃冰箱中保存。其中GbE中剂量组1只大鼠在灌胃中不慎刺破食管死亡。

1.4 指标检测 肝组织PDGFmRNA表达采用RT-PCR法：Trizol抽提总RNA，紫外分光光度计测定提纯度和浓度，逆转录合成cDNA，再取cDNA于下列反应体系中进行PCR反应：10×Buffer 4μL、dNTP 10mM/L（0.8μL）、MgCl225mmol/L（4μL）、5U TaqD⁃NA多聚酶（0.5μL）、模板4μL、上、下游特异引物各1μL，加去离子水至40μL。先在94℃预变性3min，然后分别按下述条件循环：①PDGF：变性94×20s，退火68×30s，延伸72×40s，10个循环，-1℃，再变性94× 20s，退火58×30s，延伸72×40s，30个循环；②GAP⁃DH：变性94℃15s、退火57℃30s、延伸72℃C30s，35个循环；最后均72℃延伸10min，4℃冷却5min结束反应。反应产物在2%琼脂糖凝胶进行电泳2h。采用BioSenSC300凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，计算PDGF与GAPDH的比值。肝组织PDGF蛋白表达采用免疫组织化学二步法，PDGF阳性细胞为细胞浆呈棕黄色，根据着色程度及着色细胞阳性范围进行半定量计分[3］。

1.5 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件，数据用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析、非参数秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

模型组大鼠肝组织PDGFmRNA和蛋白表达水平均显著高于正常组（P＜0.01）；GbE中、高剂量组和复方鳖甲软肝片组大鼠肝组织PDGFmRNA和蛋白表达水平均不同程度低于模型组（P＜0.05，P＜0.01），GbE低剂量组PDGFmRNA表达较模型组显著降低（P＜0.05），蛋白表达则与模型组差异无统计学意义（P＞0.05），见表1，图1～2。

表1 各组大鼠肝组织PDGFmRNA和蛋白的表达（）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

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3 讨 论

肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纤维化发生发展的核心环节，目前已经证实有多种因素协同作用参与了HSC的激活、增殖和细胞外基质的合成过程。PDGF是HSC强力有丝分裂原，在肝脏主要由库否细胞产生，以AA、AB、BB三种形式存在，通过自分泌和旁分泌的方式发挥作用，促进HSC活化、增殖，并诱导HSC合成TGF等细胞因子，使形成肝纤维化的主要成分细胞外基质合成和分泌增多，同时抑制胶原降解，在肝纤维化的发生、发展中发挥重要作用[4-6］。本研究发现，肝纤维化模型组大鼠PDGF-BBmRNA及蛋白的表达较正常组明显增加（P＜0.01），提示纤维化时PDGF的分泌和合成增加。GbE和复方鳖甲软肝片干预后PDGF-BBmRNA和蛋白表达水平较模型组明显减少（P＜0.05，P＜0.01），结合前期研究GbE和复方鳖甲软肝片能抑制肝星状细胞活化，改善肝组织炎症活动程度和纤维化程度的结果［1-2］，提示EbG和复方鳖甲软肝片抗大鼠肝纤维化的作用可能与其降低肝组织PDGF表达有关。

［1］高晓倩，陈芝芸，张晓苹，等.银杏叶提取物抗肝纤维化作用的研究［J］.中华中医药学刊，2008，26（4）：779-781.

［2］姚嘉明，陈芝芸，严茂祥，等.银杏叶提取物对肝纤维化大鼠TGF-β1表达的影响［J］.中国中医药科技，2008，15（3）: 186-188.

［3］徐列明，刘平，吕刚，等.Ⅰ、Ⅳ型胶原及板层素在肝纤维化大鼠肝窦周围的变化［J］.中华消化杂志，1995，15（3）: 146-148.

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［5］Liu Y，Wen XM，Lui EL，etal.Therapeutic targeting of the PDGF and TGF-beta-signaling pathways in hepatic stellate cells byPTK787/ZK22258［J］.Lab Invest，2009，89（10）: 1152-1160.

［6］SiHF，LV X，Guo A，etal.Suppressive effectof leflunomide on rat hepatic stellate cell proliferation involves on PDGFBB-elicited activation of three mitogen-activated protein kinases［J］.Cytokine，2008，42（1）:24-31.

Effects of Ginkgo Biloba Extract on the Expression of Platelet-derived Grow th Factor in Rat Liver Tis⁃sues w ith Hepatic Fibrosis

LI wan’er，CHEN Zhiyun，YAN Maoxiang，et al.Zhejiang Aged Care Hospital,Hang⁃zhou(310015),China

Objective:To investigate the effects of ginkbo biloba extract(GbE)on the expression of platelet-de⁃rived growth factor(PDGF)in rat liver tissues with hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride(CCL4). M ethods:Rat models of hepatic fibrosis were induced by CCL4and were treated with GbE of 50,100,and 200 mg/kg·d,respectively,for 6 weeks.Biejia Ruangan tablets served as control treatment.At the end of the 6th week,all the rats were painless killed.The transcription of PDGF mRNA in the livers of these rats was ana⁃lyzed by RT-PCR and the expression of PDGF protein was detected by immunohistochemistry.Results:The ex⁃pressions of PDGF mRNA and protein were remarkably higher in rat livers with hepatic fibrosis than those in normal ones(P＜0.01),while both GbE and Biejia Ruangan tablets significantly reduced the expressions of PDGF at both levels when compared with the model ones(P＜0.05,P＜0.01).Conclusions:CCL4-induced hepatic fibro⁃sis may be inhibited by GbE through reducing the expression of PDGF in rat livers.

rats liver fibrosis Ginkgo biloba extract platelet-derived growth factor

2013-01-09

浙江省中医药重点研究项目目计划（No.2006Z0060）、浙江省中医药青年课题研究计划（No.2009YA006）

陈芝芸，Tel：13395812025； E-Mail：zhiyuan_chen63@yahoo.com.cn