龙葵氯仿提取物对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响

高聚伟 浙江中医药大学附属第三医院肿瘤科 杭州 310007

潘 磊 陈培丰 浙江中医药大学附属第一医院肿瘤科

龙葵氯仿提取物对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响

高聚伟 浙江中医药大学附属第三医院肿瘤科 杭州 310007

潘 磊 陈培丰 浙江中医药大学附属第一医院肿瘤科

目的：观察龙葵氯仿提取物对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响。方法：设龙葵氯仿提取物低、中、高三个剂量组（分别以1mg/mL浓度50、300、500μL加药）和空白对照组，运用流式细胞术观察其结果。结果：与空白对照组比较，不同剂量的龙葵氯仿提取物作用于A549细胞24h后，早期凋亡细胞百分比依次增至4.6%、16.8%和23.6%；晚期凋亡细胞及坏死细胞百分比依次增至1.1%、1.1%和28.9%。其中龙葵提取物高剂量组，早期凋亡细胞比例和晚期凋亡细胞及坏死细胞比例均明显高于空白对照组（P＜0.01）。结论：龙葵氯仿提取物可诱导A549细胞凋亡并呈剂量依赖性；诱导肿瘤细胞凋亡和坏死可能是龙葵氯仿提取物抑制肿瘤细胞增殖的主要作用机制之一。

人肺腺癌 A549细胞 凋亡 龙葵氯仿提取物

龙葵是茄科（Solanaceae）茄属植物龙葵（Solanum nigrum Linne）的全草。临床常用龙葵属紫茎龙葵，为一年至多年生草本植物。中医使用龙葵历史悠久，认为该中药味苦，性寒、微甘，有小毒；归肺，肾二经。有清热解毒、活血化瘀、利水消肿、止咳祛痰等功效。近年还发现该中药有抗癌作用，被用于治疗各种恶性肿瘤。我们前期研究发现，龙葵氯仿提取物对体外培养的人肝癌HepG2、人肺腺癌A549及人宫颈癌HeLa细胞增殖有较明显的抑制作用，并有一定的量效关系[1]。本研究观察龙葵氯仿提取物对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物 龙葵购自浙江中医药大学附属第一医院中药房，产地为浙江临安，经该院徐锡山主任药师鉴定为为茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)植物龙葵（Solanum nigrum L.）的干燥全草。参考文献[2-3]称取干燥的龙葵饮片5kg，用8倍量的石油醚80℃提取2h，提取液除菌100℃℃水浴箱浓缩得浸膏，即为龙葵石油醚提取物。将经石油醚提取后的龙葵晾干后依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水提取，分别得各自提取物，置4℃冰箱保存备用。

精密称取龙葵氯仿提取物20mg，溶解于0.5mLDMSO中，旋涡震荡使其全部溶解，其终浓度均为40mg/mL，置于-20℃冰箱保存备用。取龙葵氯仿提取物母液25μL，溶解于75μLDMSO中，旋涡震荡使其全部溶解，加入900μLRPMI-1640培养液，其终浓度均为1mg/mL，充分混匀后置于-20℃冰箱保存备用。

1.2 细胞与细胞培养[4]人肺腺癌A549细胞，由浙江中医药大学生命科学学院细胞实验室提供。分别从-80℃低温冰箱中取出冻存的A549细胞，37℃水浴中使其快速融化，1 000rpm/min，5min离心，收集细胞置于25mL的培养瓶，37℃饱和湿度、5%CO2的恒温培养箱中培养。取对数期生长的A549细胞，弃去旧培养液，D-hank’s液清洗两遍，加入一定量的胰蛋白酶消化5～10min至细胞皱缩，加入含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液终止胰蛋白酶消化，轻轻吹打瓶壁细胞，收集于试管中，1 000rpm/min，5min离心，弃上清，1:2传代，继续培养。

1.3 试 剂 RPMI-1640：美国GIBCOBRL公司，批号1083956。FCS：杭州四季青生物工程材料研究所，批号20100316。1:250胰蛋白酶：吉泰科技有限公司，批号201004。碘化丙啶（propidium idoide，PI），上海佳和生物科技有限公司。二甲基亚砜（DMSO）：江苏鸿声化工厂，批号1128730。Annexin V-EGFP/PI双染细胞凋亡检测试剂盒：南京碧波生物科技有限公司。

1.4 实验仪器 Heraeus三气细胞培养箱：德国Her⁃aeus公司。倒置荧光显微镜：日本OLYMPUS公司。LDS-ZA型低速离心机：北京医用离心机厂。FACS⁃Canto流式细胞仪：美国BD公司。

1.5 方 法 取收集好的A549细胞，计数，传6孔板，每孔2mL细胞悬液，待细胞融合至80%时加药，设龙葵氯仿提取物低、中、高三个剂量组，分别以1mg/mL浓度50μL（0.05mg/mL）、300μL（0.3mg/mL）、500μL（0.5mg/mL）加药；同时设空白对照组，不加药。24h后凋亡检测，根据细胞凋亡检测试剂盒说明操作：①在进行完细胞凋亡刺激后，1 000rpm离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。②取（1～5）×105重悬的细胞，1 000rpm离心5min，弃上清，加入500μL结合液轻轻重悬细胞。③加入5μL Annexin V-EGFP，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶，轻轻混匀。④室温（20-25℃）避光孵育10min（使用铝箔进行避光）。⑤随即进行流式细胞仪检测。

1.6 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据处理，百分比用%表示，率的比较用Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

不同剂量的龙葵氯仿提取物作用于A549细胞24h后，早期凋亡细胞（右下象限B4，Annexin V+/ PI-）的凋亡率，高、中剂量组分别为16.8%、23.6%，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；而低剂量组凋亡率为4.6%，与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。晚期凋亡细胞及坏死细胞（右上象限B2，Annexin V+/PI+）的凋亡率高剂量组为28.9%，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；中、低剂量组凋亡率均为1.1%，与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。活细胞（左下象限B3，Annexin V-/PI-）的凋亡率，空白对照组为98.6%，而高、中、低剂量组分别为47.5%、82.1%和94.3%，其中高、中剂量组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。细胞收集过程中产生的损伤细胞（左上象限B1，Annexin V-/PI+），各用药组与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1。

3 讨论

细胞凋亡（apoptosis）指细胞在生长、发育和分化过程中，由基因调控产生的细胞自主、有序的主动性自发死亡现象，是生理性细胞死亡的主要方式，故又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）[5]。自从细胞凋亡概念提出后，目前凋亡研究已渗透到生物学、基础医学、临床治疗和药物筛选等许多领域，特别是凋亡与肿瘤发病机制及肿瘤治疗研究已成为当今医学界肿瘤研究的热点之一。人们认识到肿瘤的发生发展是由于肿瘤细胞的生长与凋亡失衡造成的，因此，诱导凋亡也可作为肿瘤疗效评价的一项指标[6-9]。

本研究在前期研究的基础上，运用流式细胞术检测不同浓度龙葵氯仿提取物对人肺腺癌A549细胞的凋亡的影响，对其抗肿瘤机制进行进一步的探讨。结果显示，与空白对照组比较，不同剂量（50μL、300μL、500μL）的龙葵氯仿提取物作用于A549细胞24h后，早期凋亡细胞百分比依次增至4.6%、16.8%和23.6%；晚期凋亡细胞及坏死细胞百分比依次增至1.1%、1.1%和28.9%。其中龙葵提取物高剂量组，其早期凋亡细胞比例和晚期凋亡细胞及坏死细胞比例均明显高于空白对照组（P＜0.01）。这些结果表明，龙葵氯仿提取物能诱导A549细胞凋亡并呈剂量依赖性。故诱导肿瘤细胞凋亡和坏死可能是龙葵氯仿提取物抑制肿瘤细胞增殖的主要机制之一。

［1］高聚伟.龙葵氯仿及正丁醇提取物时Lewis肺癌小鼠移植瘤作用及其机理研究［D］.浙江中医药大学，2012.

［2］谢秀琼.中药新制剂开发与应用［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2006：70-71.

［3］卢艳花.中药有效成分提取分离技术［M］.第2版.北京：化学工业出版社，2008：2-7.

［4］司徒镇强，吴正军.细胞培养［M］.第2版.北京：世界图书出版公司，2007：19.

［5］成军.程序性细胞死亡与疾病［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：101-120.

［6］Marx J.Cell death studies yield cancer clues［J］.Science，1993，259（5096）:760-761.

［7］Kerr JF,Winterford CM,Harmon BV.Apoptosis:its signifi⁃cance in cancerand cancer therapy［J］.Cancer，1994，73（8）: 2013-2026.

［8］Altieri DC.Survivin,versatilemodulation of cell division and apoptosis in cancer［J］.Oncogene，2003，22（53）:8581-8589.

［9］Tsuda H,Sata M,Ijuuin H，et al.A novel strategy for remis⁃sion induction and maintenance in cancer therapy［J］.Oncol Rep，2002，9（1）:65-68.

Influence of Chloroform Extract from Solanum nigrum L on Human Lung Adenocarcinoma A549 Cell Apoptosis

GAO Juwei，PAN Lei，CHEN Peifeng.Department of Oncology,the Third Affiliated Hospital of Zheji⁃ang Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China

Objective:To observe the influence of chloroform extract from Solanum nigrum L on human lung ade⁃nocarcinoma A549 cell apoptosis.Methods:Low,middle,and high dosage groups of chloroform extract from Sola⁃num nigrum L(50,300,and 500μg)and control groups were set and flow cytometry was used to observe cell apoptosis.Results:Compared with the control group,after being treated with different dosages of chloroform ex⁃tract from Solanum nigrum L,the percentage of early apoptotic A549 cells increased to 4.6%,16.8%,and 23.6%, and the percentage of late apoptotic cells/necrotic cells increased to 1.1%,1.1%,and 28.9%.A significant dif⁃ference in the percentages of cell apoptosis was noted between the high dosage group of chloroform extract from Solanum nigrum L and the control group(P＜0.01).Conclusion:Chloroform extract from Solanum nigrum L can induce apoptosis of A549 cells,and showed a dose-effect relationship.Induction of tumor cell apoptosis and ne⁃crosis may be one of the main mechanisms of the extract on inhibiting proliferation of tumor cells.

human lung adenocarcinoma A549 cell apoptosis chloroform extract from Solanum nigrum L

2012-12-12

浙江省中医药管理局资助项目（No.A210907）

陈培丰，Tel：0571-87072196；E-mail：CPF12345@163.com