MicroRNA与哺乳动物的性腺发育

向 浩，张晓东，凌英会，丁建平＊，章孝荣＊

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036；2.安徽地方畜禽遗传资源保护与生物育种省级实验室，安徽合肥230036）

MicroRNA（miRNA）是一类长约21～24nt的单链小分子RNA，是非编码RNA 家族的重要成员之一，一般通过碱基配对的方式与靶mRNA 的3′非翻译区（3′Untranslated Regions，3′UTR）结合，从而降解靶mRNA 或抑制其表达，但并不影响其转录，它们在植物、线虫到人类的细胞中均广泛存在［1］。1993年，Lee等［2］研究人员最先发现miRNA是在秀丽新小杆线虫（C.elegans）中控制线虫时序性发育的小分子RNA：lin－4；时隔7年之后，Reinhart等［3］发现了另一个具有转录后调节功能的小分子RNA：let－7；在之后的几年时间里，大量长度类似的小分子RNA 被相继发现，并被研究人员命名为microRNA（miRNA）［4］。据推测，人类基因组中约有2／3的基因受到miRNA 的调控，而且miRNA 与靶基因之间广泛存在着“一对多”和“多对一”的关系，这使得机体内miRNA 与靶基因之间存在复杂的调控网络［5］。

研究表明，miRNA 与哺乳动物的性腺功能及繁殖性状密切相关。miRNA 在哺乳动物的卵巢和睾丸等生殖器官、组织中广泛表达，其表达量随性腺发育呈现动态变化，且能通过与性腺激素的相互作用而影响性腺发育及其内分泌活动，对卵巢和睾丸的正常发育影响巨大；另外，miRNA 还能促进卵母细胞的成熟和精子的分化，对受精卵发育也有重要的调控作用。

1 miRNA 的生物合成与作用方式

miRNA 的生物合成途径（图1）可分为多个步骤。首先，miRNA 基因由RNA 聚合酶II转录成长链初级miRNA（pri－miRNA），接下来，这些初级miRNA 经过分步分区处理，最终形成成熟的miRNA。在这个过程中，长片段的初级miRNA 首先在核内被Ⅲ型RNA 核酸内切酶Drosha剪切成约70～90 个碱基大小的前体miRNA（pre－miRNA），Drosha和双链RNA 结合蛋白DGCR8共同作用形成了一个微型的络合物［6］；接着Pre－miRNA 在输出蛋白5（Expotin－5）的帮助下从核内转运至胞质（Ran－GTP 作为辅助因子），在胞质内，经过Ⅲ型RNA 核酸内切酶Dicer剪切成约22个核苷酸的双链miRNA［7］；最后，双链miRNA 被拆分成单链的成熟miRNA［8］。

成熟的miRNA 与RNA 诱导的沉默复合体（miRISC，也被称作核糖核蛋白复合体（miRNP））结合而发挥作用。在RISC上，miRNA 可以通过两种不同的方式下调控靶基因的表达（图1），即抑制翻译或降解靶mRNA，具体是哪种方式由miRNA 和靶基因结合蛋白Argonaute家族的互补程度决定：完全互补则会降解靶mRNA，只有部分互补则会抑制其翻译［9－10］，准确的翻译抑制机制目前尚不清楚。以mRNA 为靶目标的miRNA 可能会被扣押在核糖体上［11］，或者被补充到细胞质处理小体（Pbodies）中，并最终被降解［12］。

图1 miRNA 的生物合成过程及作用方式［13］Fig.1 The mode of biosynthesis and action of miRNA

2 miRNA 与卵巢功能

2.1 miRNA 与卵泡发育

研究表明，卵泡的正常发育和排卵的正常进行，需要大量基因表达产物的参与协调，且必须保证这些基因表达和信息交流在时空上的准确性，而miRNAs在此过程中也起到了重要作用。Tang等［14］对小鼠成熟卵细胞中的miRNAs进行了检测，结果发现了miR－30、miR－16、let－7 以及miR－l7－92 家族等多种miRNAs。Alford等［15］通过研究从妇女体内得到卵母细胞的颗粒／卵丘细胞发现，其中也存在着如miR－23a、miR－23b、miR－17－5p、miR－211和miR－542－3p等多种miRNAs。Munir［16］等通过建立牛卵巢miRNA 文库发现了50 个已知的和24 个新的miRNA 克隆，其中Bta－miR－29a在卵泡细胞的各个发育阶段均特异性表达。Hyo等［17］为了查明小鼠新生儿（NB）卵巢中miRNA 的表达情况，对小鼠NB卵巢组织中提取的miRNA 进行了测序。结果显示，let－7家族的表达最为丰富，MMU－MIR－672、MMU－MIR－322、MMU－miR－503和MMU－MIR－465家族是表达最丰富的X 染色体－连锁的miRNA。其中，MMU－miR－503、MMU－MIR－672 和 MMUMIR－465在睾丸和卵巢中优先表达［17］。

2.2 miRNA 与卵母细胞成熟

Murchison等［18］研究发现，在生发泡期的卵母细胞中，Dicer1的表达量很高，而随着卵母细胞的逐渐成熟以及受精活动的进行，其表达量逐渐降低，到2－细胞胚胎时其表达量降到了最低值。对卵母细胞特异性Dicer1－／－鼠（Dicer敲除小鼠，导致Dicer的表达量大幅下降）的研究表明，在卵母细胞的成熟过程中，miRNA 起到非常重要的作用，对Dicer1－／－鼠减数分裂时期的卵母细胞进行芯片分析的结果显示，共有861个mRNA 上调，而有173个mRNA 下调。由此推测，在卵母细胞中，miRNA 可能是通过对这些转录产物的调控来调节卵母细胞的成熟。Yao［19］等研究发现，MicroRNA－224通过和靶基因Smad4的作用来参与转化生长因子β介导的小鼠颗粒细胞的增殖和功能。而Martha等［20］研究发现，miR－21有阻碍小鼠排卵前颗粒细胞凋亡的功能。

2.3 miRNA 与卵巢性腺激素

Lam 等［21］发现，在雌性正常的生殖过程中，卵巢雌激素和孕酮的周期性变化对于排卵、胚胎着床和月经周期等是必不可少的环节。最近大量的研究表明，miRNA 通过与卵巢性腺激素之间的相互影响，实现对雌性动物生殖过程的调控。

一方面，类固醇激素影响miRNA 的生成。Pan等［22］发现，原代培养的人子宫内膜间质和腺上皮细胞经过17β－雌二醇和乙酸甲羟孕酮处理后，miR－20a、miR－21 和 miR－26a 的表达受到了影响。Yamagata等［23］研究发现，活化的雌激素受体（es－trogen receptor，ER）能通过与Drosha的相互作用来抑制pri－miRNAs的成熟，并最终导致这些miRNAs所作用的靶基因表达量增大。此外，Kuokkanen等［24］比较了人增殖期和分泌期子宫内膜中miRNAs的表达差异情况，结果显示，与增殖期相比，有miR－29b、miR－29c、miR－30b、miR－30d、miR－31、miR－193a－3p、miR－200c、miR－203、miR－204、miR－210、miR－345和miR－582－5p共12个miRNAs在分泌期表达量显著升高，而孕酮在此过程中起到了关键性的作用。

另一方面，miRNAs同样会影响卵巢类固醇激素的生成。Sirotkin 等［25］研究了miRNAs对人卵巢细胞分泌的主要性腺类固醇激素的影响，体外研究结果显示，如分别转染let－7b、let－7c和mir－15a等36种miRNAs，可提高人颗粒细胞孕酮的分泌量，而mir－16、mir－24和mir－25等10、51和57种miRNAs则会分别使孕酮、睾酮和雌二醇表达量降低，且有的抑制作用可高达4.5倍。有意思的是，Alexander等［26］也做了相似的研究，结果发现，在检测的80种miRNA 中，有36种抑制孕酮的分泌，而有10种促进孕酮的分泌。

此外，除类固醇激素外，促性腺激素也能调节miRNAs的生成。Fiedler等［27］对人排卵期卵泡颗粒细胞的研究发现，有13个miRNAs受LH（黄体生成素）调节，且对miR－132 和miR－212 这两个miRNA 的上调作用明显。Yao等［28］在体外培养了大鼠的颗粒细胞，并研究了孕酮对其miRNA 表达量的影响，结果发现，用孕酮对颗粒细胞处理12小时后，miR－29A 和miR－30D 的表达量显著下调；而处理48h 后，他们的表达量都增加。Yao等［29］发现，FSH（卵泡刺激素）对小鼠颗粒细胞中let－7a、miR－125b和miR－143的表达具有抑制作用。Yong等［30］研究了hCG（human chorionic gonadotrophin，人绒毛膜促性腺激素）对体外培养的小鼠卵泡细胞和颗粒细胞中miRNA 表达的影响，结果发现，相对于不添加hCG 的组，添加hCG 的卵泡细胞中miR－126，miR－143 和miR－721 的表达量下调；而添加hCG 的颗粒细胞中mmu－let－7b 表达量下调，其他的miRNA 的表达量在两种细胞中没有明显差异。

3 miRNA 与睾丸功能

3.1 miRNA 在睾丸中的表达

对于miRNA 在哺乳动物睾丸中的表达情况，研究人员们也做了一些研究。Yan等［31］以灵长类动物的睾丸组织为材料进行了研究，结果在恒河猴的未成熟和成熟的睾丸组织中共检测到66个（占总数的26.4%）差异表达的miRNA，其中23个上调，43个下调；而在人的未成熟和成熟的睾丸组织中共检测到76个（占总数的31.3% ）差异表达的miRNA，其中有28 个上调，48 个下调。这些miRNAs可能调控精母细胞和精细胞在精子发生过程中的形成和分化。Lian等［32］研究发现，miR－122的表达量在成年猪的睾丸发育成熟的过程中逐渐升高；而miR－221的表达量在此过程中逐渐降低，这个结果说明miR－122和miR－221可能在睾丸的发育过程中起到不同的作用。他们在2012年分别建立了未成熟和成熟猪睾丸组织的小RNA 文库，检测发现了389种已经发现的或同源性的miRNAs，15种新的在猪上特异表达的miRNAs和56 个新的候选miRNAs。其中有122个miRNAs在未成熟和成熟猪睾丸组织中差异表达，且其中的10种经RT－PCR进行了验证［33］。

3.2 miRNA 与精子发生

与正常的体细胞不同，成熟的精子作为生殖细胞是一种特殊的单倍体细胞，其正常发生要经历一系列复杂的过程，离不开众多与之相关因子之间的精准调控。Katsuhiko等［34］发现，在小鼠精子发生过程中，miR－17－92 家族和miR－290－295 家族在精原细胞中高表达。Tong等［35］研究发现，miR－17－92和miR－106b－25可能会使Bim，Kit，Socs3 和Stat3的表达量下调；miR－17－92敲除小鼠会出睾丸缩小、产精数减少和精子发生减弱的现象；在精细胞内，miR－17－92表达量的减少会增加miR－106b－25的表达量，这些结果表明，miR－17－92和miR－106b－25可能通过相互协作的方式来调节精子发育。Liang等［36］研究发现，miR－34C 在精子细胞中高度表达，它能通过与靶基因ATF1的作用促使小鼠雄性生殖细胞凋亡。Mciver等［37］比较了小鼠精原细胞和精母细胞表达miRNA 的差异情况，结果显示miR－293、miR－291A－5P、miR－290－5p和miR－294 表达量上调，miR－136、miR－743a和miR－463表达量下调。

4 miRNA 与受精卵发育

受精卵是哺乳动物个体发育的起点，精卵融合成受精卵，并逐步发育成早期胚胎乃至个体，对于miRNA 与之的关系，也有人做了相关研究。Tang等［14］研究发现miR－17－92和let－7家族是受精卵中含量最丰富的母源miRNAs，他们进一步分析了在未成熟卵子逐渐发育成早期胚胎的过程中，未成熟卵子、成熟卵子、受精卵以及早期胚胎miRNA 的表达谱差异，结果显示，miRNA 的表达量会出现先降低，之后又上调的情况。此外，Tripurani等［38］发现，miR－196a 通过表达量的持续升高，导致NOBOX（新生儿卵巢同源盒基因）的表达量降低，从而调节小鼠的早期胚胎发育。Ronald等［38］对小鼠的早期胚胎的研究表明，miR－135A 能通过下调靶基因SIAH1A 的表达量来调节早期胚胎的体外发育。

5 小结

miRNA 能够通过与靶mRNA 特异性的碱基配对引起靶mRNA 的降解或者抑制其翻译，从而实现对基因转录后表达的调控。研究表明，miRNA广泛参与哺乳动物卵泡发育、精子发生、激素分泌、受精卵发育、妊娠维持等重要的生殖活动，与哺乳动物的性腺发育关系密切。但这其中还存在着一些问题，比如这些结果主要来自于小鼠和人，在其他哺乳动物上的研究还有待深入；有些是体外试验的结果，在体内的情况还不太清楚；而且，虽然越来越多的miRNA 已用不同的方法成功鉴定出来，但是单一某种miRNA 在哺乳动物生命活动中的作用及其机理也还有待更加深入的研究。

［1］David P B.MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116：281－297.

［2］Lee R C，Feinbaum R L，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin－4encodes small RNAs with antisense complementarity to lin－14［J］.Cell，1993，75：843－854.

［3］Reinhart B J，Slack F J，Basson M，et al.The 21nucleotide let－7RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，2000，403：901－906.

［4］周冬根，罗玉萍，李思光.MicroRNA 的结构、生物合成及功能［J］.生物技术通报，2005（5）：20－26.

［5］Shalqi R，Lieber D，Oren M，et al.Global and local architecture of the mammalian microRNA－transcription factor regulatory network［J］.PloS Comput Biol，2007，3（7）：e131.

［6］Rana T M.Illuminating the silence：understanding the structure and function of small RNAs［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8：23－36.

［7］Filipowicz W，Bhattacharyya S N，Sonenberg N.Mechanisms of post－transcriptional regulation by microRNAs：are the answers in sight［J］.Nat Rev Genet，2008，9：102－114.

［8］Hutvagner G.Small RNA asymmetry in RNAi［J］.FEBS Letters，2005，579：5 850－5 857.

［9］Doench J G，Petersen C P，Sharp P A.siRNAs can function as miRNAs［J］.Genes Dev，2003，17：438－442.

［10］Zeng Y，Yi R，Cullen B R.MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms［J］.Proc Natl Acad Sci，2003，100：9 779－9 784.

［11］Seggerson K，Tang L，Moss E G.Two genetic circuits repress the Caenorhabditis elegans heterochronic gene lin－28after translation initiation［J］.Dev Biol，2002，243：215－225.

［12］Liu J，Valencia－Sanchez M A，Hannon G J，et al.MicroRNA－dependent localization of targeted mRNAs to mammalian P－bodies［J］.Nat Cell Biol，2005，7：719－723.

［13］Jason B，Julang L.MicroRNAs and ovarian function［J］.Journal of Ovarian Research，2012，5：1－8.

［14］Tang F，Kaneda M，Carroll D O，et al.Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic development［J］.Genes Dev，2007，21：644－648.

［15］Alford C，Toloubeydokhti T，Al K Y，et al.The expression of microRNA（miRNA）mir－23aand 23b and their target gene，CYP19A1（aromatase）in follicular cells obtained from women undergoing ART［J］.Fertil Steril，2007，88：166－167.

［16］Munir H，Nasser G，Michael H，et al.Identification and characterizati on of miRNAs expressed in the bovine ovary［J］.BMC Genomics，2009，10：443.

［17］Hyo W A，Ryan D，Zhao M H，et al.MicroRNA transcriptome in the newborn mouse ovaries determined by massive parallel sequencing［J］.Molecular Human Reproduction，2010，16（7）：463－471.

［18］Murchison E P，Stein P，Xuan Z，et al.Critical roles for Dicer in the female germline［J］.Genes Dev，2007，21（6）：682－693.

［19］Yao G D，Yin M M，Lian J，et al.MicroRNA－224Is Involved in Transforming Growth Factor－β－Mediated Mouse Granulosa Cell Proliferation and Granulosa Cell Function by Targeting Smad4［J］.Mol Endocrinol，2010，24（3）：540－551.

［20］Martha Z C，Stephanie D F，Lane K C.MicroRNA 21Blocks Apoptosis in Mouse Periovulatory Granulosa Cells［J］.Biology of Reprodution，2010，83：286－295.

［21］Lam E W，Shah K，Brosens J.The role of microRNAs and FOXO transcription factors in cycling endometrium and cancer［J］.Journal of Endocrinology，2011，212：13－37.

［22］Pan Q，Luo X，Toloubeydokhti T，et al.The expression profile of micro－RNA in endometrium and endometriosis and the influence of ovarian steroids on their expression［J］.Mol Hum Reprod，2007，13（11）：797－806.

［23］Yamagata K，Fujiyama S，Ito S，et al.Maturation of microRNA is hormonally regulated by a nuclear receptor［J］.Mol Cell，2009，36（2）：340－347.

［24］Kuokkanen S，Chen B，Ojalvo L，et al.Genomic profiling of microRNAs and messenger RNAs reveals hormonal regulation in microRNA expression in human endometrium［J］.Biol Reprod，2010，82（4）：791－801.

［25］Sirotkin A V，Ovcharenko D，Grossmann R，et al.Identification of microRNAs controlling human ovarian cell steroidogenesis via a genome－scale screen［J］.Cell Physiol，2009，219（2）：415－420.

［26］Alexander V S，Dmitriy O，Roland G，et al.Identification of MicroRNAs Controlling Human Ovarian Cell Steroidogenesis Via a Genome－Scale Screen［J］.Cell Physiol，2009，219：415－420.

［27］Fiedler S D，Carletti M Z，Hong X，et al.Hormonal regulation of MicroRNA expression in periovulatory mouse mural granulosa cells［J］.Biol Reprod，2008，79（6）：1 030－1 037.

［28］Yao N，Yang B Q，Liu Y，et al.Follicle－stimulating hormone regulation of microRNA expression on progesterone production in cultured rat granulosa cells［J］.Endocrinol，2010，38：158－166.

［29］Yao N，Lu C L，Zhao J J，et al.A network of miRNAs expressed in the ovary are regulated by FSH［J］.Front Biosci，2009，14：3 239－3 245.

［30］Yong J K，Seung Y K，Zev R，et al.MicroRNA Expression Profiles are Altered by Gonadotropins and Vitamin C Status During In Vitro Follicular Growth［J］.Reproductive Sciences，2010，17（12）：1 081－1 089.

［31］Yan N H ，Lu Y H，Sun H Q，et al.Microarray profiling of microRNAs expressed in testis tissues of develop ing primates［J］.Assist Reprod Genet，2009，26：179－186.

［32］Lian C J，Niu S L，Yang R J，et al.Expression Profiles of miR－122and miR－221in Porcine Various Tissues and Developing Testes［J］.Animal and Veterinary Advances，2011，10（S）：3 380－3 384.

［33］Lian C J，Sun B X，Niu S L，et al.A comparative profile of the microRNA transcriptome in immature and mature porcine testes using Solexa deep sequencing［J］.FEBS，2012，279：964－975.

［34］Hayashi K，Chuvade S L，Kaneda M，et al.MicroRNA Biogenesis Is Required for Mouse Primordial Germ Cell Development and Spermatogenesis［J］.PLOS ONE，2008，3（3）：e1738.

［35］Tong M H，Debra M，Samantha M，et al.Two miRNAs Clusters，Mir－17－92（Mirc1）and Mir－106b－25（Mirc3），Are Involved in the Regulation of Spermatogonial Differentiation in Mice［J］.Biology of Reproduction，2012，86（3）：72－81.

［36］Liang X，Zhou D，Wei C，et al.MicroRNA－34cEnhances Murine Male Germ Cell Apoptosis through Targeting ATF1［J］.PLOS ONE，2012，7（3）：e33861.

［37］Mciver S C，Stanger S J，Santarelli D M，et al.A Unique Combination of Male Germ Cell miRNAs Coordinates Gonocyte Differentiation［J］.PLoS ONE，2012，7（4）：e35553.

［38］Tripurani S K，Lee K B，Wee G，et al.MicroRNA－196aregulates bovine newborn ovary homeobox gene（NOBOX）expression during early embryogenesis［J］.BMC developmental biology，2011，11：1－9.

［39］Pang R T K，Liu W M，Leung C O N，et al.miR－135ARegulates Preimplantation Embryo Development through Down－Regulation of E3Ubiquitin Ligase Seven in Absentia Homolog 1A （SIAH1A）Expression［J］.PLOS ONE，2011，6（11）：e27878.