优良酵母菌株的分离和筛选

刘晓辉，张效川，辛小玲，白延琴，徐文华，蔡 涛，辛亚平，昝林森

（1.天津市兽药饲料监察所，天津300210；2.吴起县畜牧局，陕西吴起717600；3.富平县畜牧兽医工作站，陕西富平711700；4.子长县畜牧兽医局史家畔畜牧兽医站，陕西子长717300；5.榆林市榆阳区牛家梁镇畜牧兽医工作站，陕西榆林719000；6.渭南市畜牧技术推广中心，陕西渭南714000；7.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

酵母是一种肉眼看不见的微小单细胞微生物，能将糖发酵成酒精和二氧化碳，是一种天然发酵剂，分布于整个自然界，它有自己的生命现象，是一种典型的兼性厌氧微生物，在有氧气和没有氧气存在的条件下都能够存活［1］。酵母菌是人类文明史中被应用得最早的真菌类微生物。利用酵母菌发酵饲草饲料，具有成本低、原料广、周期短、产量高等优点，可提高饲料营养物质的消化率和吸收率，减少饲料原料浪费，同时缓解蛋白质饲料资源日益短缺的矛盾，促进我国畜牧业结构转型，推动畜牧业进一步发展［2］。本试验采用麦芽浸粉培养基和秸秆粉培养基，利用平板划线法，从富含酵母菌的青贮饲料和酒糟饲料中分离出酵母菌，经过培养条件的优化，从中筛选出优良酵母菌株，作为饲料酵母；为饲料酵母及发酵饲料在畜牧业生产中的应用提供理论依据［3］。

1 材料与方法

1.1 材料

青贮玉米饲料、大麦啤酒糟、麦芽浸粉、秸杆粉。

1.2 方法

采用麦芽浸粉培养基，通过平板划线法从青贮饲料和酒糟饲料中分离出酵母菌，进一步纯化，至镜鉴为稳定菌落。采用秸秆粉培养基，对分离到的酵母菌株通过正交试验探索培养条件，优化温度、初始pH、装液量和接菌量等。培养48h，并测定OD 值。1.2.1 培养基的制备 麦芽浸粉培养基：葡萄糖10g、蛋白胨2g、麦芽浸粉1g、酵母膏1g、琼脂粉12g、乳酸0.3mL／L、水1 000mL、pH、121 ℃灭菌30min。

玉米秸秆粉培养基：取当年生无霉变的优质干燥玉米秸秆加工而成的0.1mm 粒度细粉20g、蛋白胨1g、葡萄糖2g、NaCl10g、琼脂粉20g、蒸溜水1 000mL，pH 6.5～7.0，121 ℃灭菌30min［4］。

1.2.2 增菌培养 在无菌条件下称量饲料样品10 g，放入带有玻璃珠的三角瓶中，加入麦芽浸粉液培养基，180r／min，30 ℃振荡培养过夜。

1.2.3 分离、纯化酵母菌 用2层无菌纱布过滤增菌液，取滤液1 mL 并稀释为10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－76个浓度梯度，各取0.5mL 均匀涂在麦芽浸粉培养基平板上，在30 ℃恒温下培养48～72h，挑选与酵母菌特征菌落相似菌落转接到斜面培养基上，平板划线纯化，分离纯化为单一菌落，无杂菌，编号后转接斜面。

1.2.4 观察酵母菌菌落形态 在麦芽浸粉液体培养基平板上接种纯化后酵母菌菌株，30 ℃恒温培养48h，并观察菌落形态。观察是否有发酵现象，清浊度，沉淀物的疏松度和紧密度等。观察菌落的形态大小，厚度，同心圈，辐射线，凹凸度，光滑度、光泽度、透明度、有无褶皱等，颜色及其他特征［5］。

1.2.5 观察酵母菌形态及出芽方式 取1 mL 纯培养菌液接种在麦芽浸粉培养基平板上，30 ℃培养48h计数，于高倍显微镜下观察出芽过程。

1.2.6 优化培养条件 纯化培养菌株后，转接到装有20mL麦芽浸粉液的100 mL 锥形瓶中，180r／min，30 ℃培养48h，并进行显微镜检测，4 ℃保存菌液备用。

表1 正交设计试验因素水平表Table 1 Factors level of orthogonal experimental design

表2 各影响因素记录表Table 2 The record of factors

采用正交设计试验设计L16（44），对培养条件的温度、初始pH、接菌量、装液量进行4个水平试验，优化培养条件，筛选出生长性能好的酵母菌菌株。然后采用玉米秸秆粉培养基，在不同条件下培养48 h，并测定生物量［5］。

通过正交试验L16（44）优化筛选出3株菌株进行生长曲线测定试验。根据正交试验的结果，按照每个菌株最适合的培养条件，在180r／min条件下培养48h。分别在0h、3h、6h、12h、18h、24h、30 h、36h、42h、48h、54h、60h、66h、72h时间点，测定其pH 值，然后将样液分别分装在两个5mL试管中，冰浴使其生长停止。设3 个重复，取其中一管测定OD 值，绘制出生长发育曲线图。

2 结果与讨论

2.1 分离酵母菌菌落和细胞个体的形态特征

在高倍显微镜下，酵母菌具有典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞核、细胞质、细胞膜、线粒体、微体、液泡等。酵母菌通常有球形、椭圆形、腊肠形、卵圆形或者藕节形等形态，无鞭毛，不能游动。本试验观察到酵母菌的生殖方式为出芽生殖（表3）。酵母菌比细菌大，约1～5μm 或5～30μm，呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，少数干燥，不透明。液体培养发酵，培养液变浑浊，有的形成浮膜、有沉淀物［6］。

从青贮饲料和大麦啤酒糟中各分离出5株疑似酵母菌珠，进行编号1～10。在培养过程中发现4号和7号菌发生衰退。其余各酵母菌株的形态大小、酵母细胞个体及出芽方式观察结果如表3所示。

2.2 培养条件优化和筛选结果

采用秸秆粉培养基，对8株分离酵母菌株通过正交试验，对培养条件温度、初始pH、装液量和接菌量等进行优化。培养48h，并测定OD 值，发现不同酵母菌株的最适宜培养条件很相似，为初始pH为5.5，32℃、接菌量为12mL／L，转速180r／min时，测定的OD 值达最高，即生物产量最高（表4）。酵母菌株不同，不同的培养条件下各因子对生物产量影响程度也不相同。在最优生长条件下，取得最高生物量的前3 株优良菌株分别为3 号（OD 值：2.186）、5 号（OD 值：2.179）和9 号（OD 值：2.198）［7］。

表3 酵母菌细胞个体和菌落形态特征及出芽方式Table 3 The characteristics and budding of yeast cell in individual and colony morphology

表4 分离酵母菌株正交试验结果Table 4 The orthogonal test results of separation yeast strains

2.3 生长曲线测定

用稀释培养法（MPN）测定生物量：（1）菌种预培养。将斜面菌种1环至盛有50 mL 种子培养基的250mL的三角瓶中，28℃、160r／min振荡，并培养24h；（2）将上述培养好的菌液按照10%的比例接入另外15瓶装有50 mL 种子培养基的250 mL三角瓶中，并标号0～15，28 ℃、160r／min 振荡培养，每间隔2h取出一瓶培养液和1mL菌液，4 000 r／min下离心5 min，弃去上清液，加入9 mL 蒸馏水，使细胞重新悬浮，在620nm 下比浊。以培养时间为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制生长曲线［8］。

通过正交试验结果（表4）筛选出3号、5号和9号菌，测定生长发育曲线（图1）。3号菌株的稳定期为42～72h，生长对数期为6～42h，42h达最高生长点（OD 值：2.132）；5号和9号菌株的生长对数期均为6～36h，稳定期为36～72h，36h达最高生长点（5号OD 值：1.902；9号OD 值：2.231）。通过比较9株菌株最高生物产量时间点可知，9号菌生物量最高（图1）。9 号菌送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行鉴定，结果为酿酒酵母［9］。

图1 3号、5号、9号酵母菌株生长曲线Fig.1 The growth curve of No.3，No.5，No.9yeast strains

3 结论

从青贮玉米和大麦啤酒糟饲料中分离10株酵母菌菌株，测定显微镜菌落形态，通过系列试验优化筛选，并鉴定其生长曲线，认为9号菌株属于酵母属，在初始pH 为5.5，温度为32 ℃、接菌量为12 mL／L，装液量为100mL／瓶，转速180r／min，培养36h时生物产量达到最高，OD 值为2.231。经过鉴定9号菌株为酿酒酵母。

［1］王晓宏，刘大程，殷兆丽，等.复合酵母培养物对奶牛生产性能的影响［J］.饲料工业，2010（10）：37－38.

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［9］辛亚平，昝林森，杜双田，等.降解纤维素菌株筛选及其鉴定［J］.畜牧兽医杂志，2011，30（5）：1－5.