婴幼儿血管瘤标志物的研究进展

马刚 综述 林晓曦 审校

婴幼儿血管瘤（Infantile hemangioma，IH）为最常见的儿童期良性肿瘤，发病率高达10%~12%，男女比例为1∶3~1∶5[1]。IH具有独特的自然病史，多数患儿出生后8~12个月血管瘤持续增生，随后的5~7年内呈现自发地缓慢消退，20%~40%患儿出现残余皮肤改变。传统的糖皮质激素治疗沿用了40多年，疗效的个体差异大，副作用多[2]。普奈洛尔（心得安）的使用，被认为是IH治疗的一次突破。该药能迅速控制增生期IH的快速发展[3]，但药物副作用尚未知晓。IH的发病机制仍未阐明，其标志物也缺乏特异性，本文就此方面的研究进展进行综述。

1 组织学标志物

1.1 血管生成相关标志物

IH一直与血管生成（Angiogenesis）联系在一起，因此促进或抑制血管生成相关的标志物研究较多[4]。血管内皮生长因子（VEGF）仅表达于增生期的IH内皮细胞（HemEC）和周细胞，VEGFR1低表达，VEFGR2出现高表达[5]。增殖细胞核抗原（PCNA）同样表达于增生期的周细胞和部分HemEC核内，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在增生期HemEC中表达显著升高。CD31和vWF在IH三期中均表达。金属蛋白酶组织抑制物（TIMP）可抑制新生血管形成，仅在消退期IH周细胞胞浆内阳性表达。E-selectin是内皮细胞特异性白细胞黏附分子，在增生期IH中表达显著增高，并与血管数量相关[6]，也被用于HemEC的分选。增生期IH组织和体外培养的HemEC中Tie2、ang1高表达，ang2低表达，提示ang/Tie通路调节IH的增生[7]。β4整合素在消退期IH中表达阳性，可作为消退期的标志物[8]。细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）在增生期IH表达增高，提示IH具有侵袭性，需积极地干预治疗，并可能成为基因治疗的靶点[9]。Notch信号通路也认为与血管生成相关，周细胞 Notch3(+)，Notch1、Notch4 和 Jagged1 在消退期IH中表达增加，而且Notch基因表达的改变反映了IH从增生到消退逐渐成熟的过程[10]。

1.2 胎盘相关标志物

2000年，North等[11]首次提出葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）在三期IH中阳性表达，而在其他血管性肿瘤和脉管畸形中不表达，随后的研究进一步证实GLUT1可作为IH特异性标志物[12]。免疫组化发现，在IH组织中还表达其他一些胎盘相关的血管性标志物， 包括 Lewis Y、CD32、FcγRI、merosin 等[13]，而在体外培养的HemEC中几乎不表达。提示IH前体细胞可能来源于胎盘或向胎盘血管表型分化的成血管细胞。胎盘生长因子（PIGF）能够预示实体肿瘤的自发消退，在消退期IH中表达阳性，而且能够负性调节VEGF-A，功能性中断内皮的增殖，促进IH的消退过程[14]。

1.3 凋亡相关标志物

IH为何在12～24个月时开始消退，最直接的原因可能与细胞凋亡相关，使用TUNEL法检测显示IH消退过程中凋亡较增生期和消退后期增加5倍，而且1/3的凋亡细胞是内皮细胞[15]。 Clusterin/apolipoprotein J（clust/apoJ）作为凋亡细胞最显著的标志物，在增生期IH中表达阴性，一旦进入消退期，即在IH内皮上显著阳性表达[16]。细胞分裂的核抗原Ki67在增生期HemEC中表达阳性，消退期表达急剧下降，提示1岁以后，凋亡逐渐抵消细胞增殖，并启动IH的消退。胰岛素样生长因子2（IGF2）是已知的促有丝分裂剂和凋亡抑制剂，还是VEGF和GLUT-1的上游调节因子。DAN表达芯片发现IGF-2在IH增生期中高表达，消退期显著下降。而且IGF-2作为一个缺氧诱导基因，通过低氧水平驱动，在IH增生中发挥作用[17]。后续研究发现增生期IH中IGF2表达于血管周围和间质细胞内，很少的内皮细胞共表达CD31和IGF2，消退期IH中间质细胞的IGF2表达急剧下降[18]。

1.4 缺氧相关标志物

缺氧是新生血管形成的一种强有力的刺激，通过调节转录因子HIF-1α发挥作用，HIF-1α活性增加，能够促进其下游缺氧应答基因比如VEGF和间质衍生因子（SDF-1α）的表达。增生期IH表现为显著的缺氧，HIF-1α表达增加，其下游靶标VEGF和SDF-1α表达也相应增加，而在消退期IH中HIF-1α表达不增加[19]。陈达等[20]发现，增生期IH中HIF-1α表达与VEGF和血管新生数量成正相关。提示IH增生期存在着特殊的缺氧微环境，并通过HIF-1α表达水平升高调节VEGF等血管生成相关因子表达水平升高，促进了新生微血管的生成。Giatromanolaki等[21]也发现HemEC中HIF-2α、VEGF、TP表达阳性，提示HIF-2α/VEGF通路活化也可能对IH生成起重要作用。

1.5 炎症相关标志物

同种异体移植炎症因子－1（Allograft inflammatory factor-1，AIF-1）在三期IH内皮细胞中均强表达，可作为IH的又一标志物[22]。IH内聚集CD8(+)细胞毒性T淋巴细胞，可能通过释放细胞因子促进血管内皮细胞的增殖。增生期高水平的吲哚胺-2,3-双加氧酶使色氨酸降解增加，抑制T细胞功能，使IH逃脱免疫监视[23]，免疫组化还发现HemEC表达血管细胞黏附分子－1（VCAM-1）和细胞间黏附分子－1（ICAM-1），可促进白细胞的聚集。

1.6 淋巴内皮相关标志物

淋巴内皮透明质酸受体-1（LYVE-1）是和肿瘤相关的淋巴管特异性标志物。研究发现，在增生期IH中，CD31(+)和CD34(+)的内皮细胞均高表达LYVE-1，而另一淋巴管内皮特异性标志物Prox-1，在增生期和消退期IH中LYVE-1、CD31和CD34三者均阳性的内皮细胞上表达均为阴性，提示HemEC为不成熟的免疫表型，与胚胎发育过程中具有淋巴分化潜能的主静脉内皮非常相似，停滞在血管分化的早期阶段，其内在的缺陷导致出生后的快速增生[24]。Nguyen等[25]研究发现，淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1、Prox-1、podoplanin和D2-40在增生期和消退期IH的血管内皮上均不表达，仅血管周围具有树突样细胞形态的HLA-DR(+)细胞表达LYVE-1，且LYVE-1的表达与IH的增生和消退无关，否定了之前的研究结果，认为IH的血管不具有淋巴管的特性。

1.7 血管原细胞（Haemangioblasts）标志物

血管原细胞是造血细胞和内皮细胞的前体细胞，在CD34(+)和 GLUT-1(+)的 HemEC 上 ，VEGFR-2 和 CD133 表达阳性，确认了EPC的表型，继而发现原始中胚层标志物brachyury、ACE也为阳性表达，提示EPC来源于血管原细胞，最终TAL-1、GATA-2也为阳性表达，确立了 CD34(+)的内皮为原始造血原内皮，具有向造血细胞和内皮细胞分化的双向潜能[26]。Itinteang等[27]研究发现，增生期CD34(+)的内皮细胞表达红细胞生成素受体（EPO-R），该EPO-R(+)细胞同时表达胚胎原性血红蛋白 ζ（haemoglobin ζ，HBZ），IH 体外组织块培养能生成无核红细胞，进一步证明IH微血管是具有功能的血管原性内皮，具有原始红细胞生成的潜能。

1.8 内皮祖细胞（endothelial progenitorcells，EPCs）标志物

增生期IH含有大量不成熟的内皮细胞，推测其可能来源于循环EPC的聚集，实验证实IH患者外周血CD34(+)、AC133(+)EPC是正常患者的15倍，体外培养的EPC能表达IH标志物GLUT1、CD32和merosin[28]。组织学研究证实，在增生期IH组织中存在CD34(+)、AC133(+)EPC[29]。IH来源的EPC （hemEPC）、hemEC和脐血来源的EPC在内皮抑素刺激后黏附、迁移和增殖能力增加，而且hemEPC反应持续更长时间[30]。增生期hemEC上表达CD14、CD83，提示hemEC可能来源于髓样细胞[31]。

1.9 干细胞标志物

Yu等[32]发现，在IH增生期成脂肪间充质干细胞（MSCs）数量显著高于消退期和正常皮肤，能够表达CD105、SH3、SH4、CD90、CD29、αSMA、CD133，不表达造血细胞标志物CD45和CD14，也不表达内皮标志物CD34、CD31和KDR。IH来源的MSCs具有强大的脂肪形成潜能。提示可以诱导MSCs加速分化为脂肪细胞，促进IH的提前消退。节段性IH伴发PHACES综合征，提示神经嵴细胞参与IH的发病机制，免疫组化发现，增生期IH内皮表达神经嵴细胞特异标志物神经营养因子受体、原始中胚层细胞转录因子brachyury、造血干细胞标志物CD133、内皮造血干细胞/祖细胞标志物CD34、内皮细胞标志物CD31和VEGFR-2、间充质干细胞标志物CD29和波形蛋白（Vimentin）以及神经嵴细胞前体的特异标志物Sox9和Sox10。同时组织块体外培养分离的hemEC也同样表达上述标志物。这些结果提示IH可能来源于具有神经嵴细胞表型的原始中胚层细胞[33]。在增生期IH中，这类同时表达神经嵴细胞和间充质干细胞标志物内皮的原始细胞也表达前脂肪细胞因子－1（Pref-1），该因子是表皮生长因子样蛋白，是阻止终末脂肪生成的关键因子，抑制脂肪细胞的分化，在增生期所有CD34(+)阳性的内皮上强表达，在消退期和正常皮肤上极少表达，在消退完成期成熟内皮上不表达。从IH组织块出芽获取的细胞能够体外诱导分化为脂肪细胞和诱导成骨[34]。

1.10 周细胞（Pericytes）标志物

周细胞又称为壁细胞，围绕在IH新生血管周围，免疫组化显示在增生期IH血管周围细胞主要表达周细胞标志物nerve/glial antigen-2（NG2），同时也表达 α-SMA 和 CD146[35]，免疫双染组织定位显示周细胞共表达PDGFR-β/α-SMA、CD133/α-SMA 和 PPAR-γ/α-SMA。 周细胞也表现间充质干细胞（MSC）的特性，具有成骨、成软骨和成脂肪的潜能。因此周细胞也具有多向分化潜能，尤其是脂肪生成，是消退完成期脂肪细胞的来源之一。壁细胞的聚集对保持血管结构的稳定至关重要，免疫组化发现增生期和消退期IH内皮周围聚集大量αSMA(+)细胞，而先天性快速消退型IH（RICH）中缺乏αSMA(+)壁细胞，血管结构的不成熟导致RICH更加早期和快速的消退[15]。

1.11 肥大细胞标志物

肥大细胞来源于造血干细胞，早在1982年Glowacki和Mulliken使用Safranin O染色计数，发现增生期IH肥大细胞数量显著高于消退期IH、血管畸形和正常皮肤[36]。Ki67染色显示消退期肥大细胞持续增生，PCNA染色显示IH增生期增生的肥大细胞比例最高，消退完成期最低。增生期肥大细胞内表达FGF和Ⅷ型胶原，提示增生期肥大细胞合成活跃，参与细胞增殖。在激素治疗后，肥大细胞数量增加4倍，此时肥大细胞生成凋亡相关蛋白clust/apoJ及其他因子，比如IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TGF-β等，这些因子同样在消退期生成增加，从而抑制血管生成[37]。因此，肥大细胞在IH增生和消退过程中发挥双重作用。

1.12 细胞外标志物

基底膜是毛细血管结构完整性的基本要素，其中层黏连蛋白（Laminins）是主要的膜蛋白，含有 α、β、γ 三条链，β2 是血管基底膜特有的，IH三期组织中均表达α1、β2、γ1，显示IH整个发展过程中血管的同源性，同时也表达基底膜特异性的基底膜聚糖（Perlecan）和IV型胶原，提示IH基底膜与正常血管基底膜的成分相同，IH中含有多层基底膜可能是细胞增殖和死亡的结果。Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原在三期IH中均表达，而且越晚期的IH中表达量越高，也与临床上IH消退过程中细胞成分减少和纤维组织增加的特性相关。Ⅷ型胶原能促进血管生成中内皮细胞的迁移、平滑肌细胞的侵入和成纤维细胞的纤维化，在IH三期中均表达，而且在增生期表达于肥大细胞内，由其主动合成，在消退过程中逐渐沉积增加[38]。

1.13 其他

CD146是一种跨膜糖蛋白，是正常血管内皮的一种标志物，而在hemEC表面不表达，而且荧光双染显示增生期和消退期IH内皮表达CD31和UEA1，周细胞表达CD146，与前两者不重叠，并且体外分离培养HemEC不表达CD146，真皮微血管内皮细胞表达 CD146。因此，CD146可用于鉴别HemEC和正常内皮细胞[39]。Wilms tumor 1（WT1）在人内皮细胞中能够被Ang2刺激后表达增加，Dhaybi等[40]在126例大样本研究中证实，WT1在血管性肿瘤的内皮细胞浆中表达阳性，而在血管畸形中表达阴性。Trindade等[41]在117例血管性肿瘤（包括 IH、NICH、RICH、TA、PG 和梭形细胞 IH）和 50例脉管畸形（包括淋巴管畸形、毛细血管畸形、静脉畸形、Ⅱ期动静脉畸形）标本中研究WT1的表达，结果发现所有血管性肿瘤中WT1表达均阳性，脉管畸形中除AVM表达阳性外，其余均为阴性。Mansuet-Lupo1等[42]报道，在正常皮肤和脉管畸形组织的毛细血管小动脉和动脉强表达WT1，在静脉中局部弱表达，在淋巴管畸形中不表达，在血管性肿瘤中，NICH、TA、血管肉瘤中表达阳性，而在增生期IH和胎盘绒毛内皮细胞上不表达，提示WT1在脉管畸形和正常皮肤内皮的表达取决于血管类型。因此，WT1作为血管性肿瘤和脉管畸形临床鉴别指标的意义有待进一步确认。

2 体液标志物

尽管IH的组织学标志物研究颇多，但需要通过活检或手术切取的方法来获得组织标本，对于临床上如何确定IH处于增生期或进入消退期，临床是否需要药物治疗以及疗效评价，不可能通过反复的手术取材的方法来实现，因此体液检测无疑是一种方便、快捷、无组织损伤的方法。该方法的研究目前主要聚焦在血清学和尿液方面。

2.1 血清标志物

2.1.1 雌激素

流行病学显示IH好发于女婴。IH的婴幼儿血清中雌二醇－17β水平异常升高，高于对照组和血管畸形（VM和PWS）患儿的4倍[43]。Yang等[44]使用放射免疫法测定血清雌二醇（E2）水平，结果显示IH患者E2水平显著高于脉管畸形和正常对照组，而脉管畸形和正常对照组之间无统计学差异；增生期IH患者E2水平也高于消退期，女婴患儿高于男婴，但无统计学差异。而且雌激素受体存在于IH细胞内，增生期IH雌激素受体结合位点增加，雌激素对内皮细胞的刺激作用增强，IH快速增生。

2.1.2 细胞因子

Zhang等[45]使用Elisa法检测增生期和消退期IH、血管畸形（毛细血管畸形和静脉畸形）、健康对照组患儿血清VEGF的水平，发现仅增生期IH患儿血清VEGF水平显著高于消退期IH、血管畸形和对照组患儿，而后三组之间无统计学差异；另外，还发现增生期IH患儿激素治疗后血清VEGF水平显著降低。该研究初步确立了IH增殖与血清VEGF浓度的伴随现象，为IH的临床鉴别诊断和治疗监控提供了简易的方法，已被国际血管性疾病协会（ISSVA）发布的血管性疾病分类文件所引用。Przewratil等[46]检测外周血和IH病灶来源的血液血清VEGF浓度，发现增生期IH患者外周血VEGF浓度显著高于消退期IH、血管畸形和正常儿童对照组，VEGF浓度与IH病灶大小和患者年龄无相关性；而无论是增生期还是消退期，IH患者病灶局部血液VEGF浓度均显著低于外周血的VEGF浓度。该结果一方面证实了血清VEGF可用于鉴别IH和血管畸形，另一方面IH局部病灶VEGF浓度的意外降低则提示了IH内皮细胞增生的内在理论，局部VEGF与IH内皮细胞VEGFR结合，导致局部浓度降低可能。Przewratil等[47]进一步检测IH血清VEGF和VEGFR的浓度，结果发现sVEGFR1轻微降低，提示可能与VEGFR1和VEGFR2失调有关，sVEGFR2无显著改变，目前sVEGFRs还不能作为IH的诊断工具。

Yang等[44]使用Elisa法检测血清bFGF，发现IH和脉管畸形患者血清bFGF水平显著高于正常对照组，而IH和脉管畸形之间无统计学差异，增生期和消退期IH患者之间也无统计学差异。Przewratil等[48]检测外周血和IH病灶来源的血清bFGF浓度，发现增生期IH患者外周血bFGF浓度显著低于消退期IH、血管畸形和正常儿童对照组，bFGF浓度与IH病灶大小和患者年龄无相关性；而无论是增生期和消退期IH患者病灶局部血液bFGF浓度均显著高于外周血的bFGF浓度。

2.2 尿液的标志物

IH患儿尿液中bFGF水平升高[5]。Dosquet等[49]使用Elisa法检测显示增生期IH患儿尿液中bFGF水平升高，而正常儿童和血管畸形患者尿液bFGF水平正常，可作为IH和血管畸形的鉴别指标，并用于治疗监测。Yang等[44]发现，IH和脉管畸形患者尿液bFGF水平显著高于正常对照组，而且IH患者尿液bFGF水平显著高于脉管畸形，增生期患者尿液bFGF水平显著高于消退期IH患者。血清和尿液中bFGF水平不一致的原因目前尚不明了。

基质金属蛋白酶（MMP）参与细胞外基质的降解和新生血管形成，MMP-2和MMP-9是能够在尿液中检测到的两种酶，Marler等[50]使用底物凝胶电泳法检测尿液MMP的表达，使用Elisa检测尿液bFGF和VEGF水平，发现53%血管性肿瘤患者、41%脉管畸形患者的尿液MMP-9和bFGF较正常对照人群显著升高，且随疾病范围和严重程度而增加。MMP-2和VEGF在血管肿瘤和脉管畸形患者尿液中无显著差异。在增生期IH患儿尿液中MMP-2的水平显著低于同年龄的正常对照组，而MMP-9在两组之间无统计学差异。因此，MMP2/9不能作为增生期IH生长率的标志物。同时也发现在增生期IH患儿接受普萘洛尔治疗后2周，尿液MMP2水平显著升高，而在后续治疗后2个月检测尿液发现无差异。MMP9在治疗过程中尿液检测始终无差异[51]。该结果与以前的研究结论相反，因此需要进一步临床验证，才能分析MMP2是否能作为临床疗效的监测指标。

总之，目前对IH标志物的研究较多，大部分都是借鉴血管生成、肿瘤、干细胞等其他领域的研究成果，但至今尚未发现与IH病程密切相关、特异度敏感度较强的血清标志物。因此，对IH的细胞、体液的特异性标志物的研究仍需努力。

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