含荧光素酶四膜虫B2086-LUC全细胞生物传感器的构建及其对重金属离子的响应

张鹏幸,许 静,卢剑功,王 伟

(山西大学生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西 太原030006)

环境中的重金属污染不能被微生物有效降解,并会通过食物链的生物积累作用富集.几乎所有的重金属都能对生物体产生毒害作用[1-2].对重金属的有效监测是对环境保护和人类健康安全保障的重要手段.理化监测方法在环境监测中起到重要的作用,但是这些方法不能区别重金属在生物系统中的有效作用部位和有效评价环境中重金属的生物利用度及遗传毒性.生物测试和生物传感器克服和补充理化监测的不足,已发展为评估重金属污染的有效工具.生物监测既可评价污染物的遗传毒性,也可针对金属离子的有效作用部位进行检测.通过观察斑马鱼胚胎发育,评价了纳米碳化钨和1,2,4-三氯苯的水生态毒理效应[3-4].全细胞生物传感器(Whole Cell Biosensor,WCB)可以特异性的对金属离子的刺激产生应激,并将信号放大,反应灵敏,监测快速,已发展为一种重要的生物监测手段[5].

纤毛类原生动物是单细胞真核生物,没有细胞壁,对环境污染具有很高的敏感性,具有对环境污染更快的响应机制[6].纤毛类原生动物用于环境污染检测的方式有2种类型：“turn off”和“turn on”[7].在“turn off”试验中,基于生长速率、发光度、细胞群落的色度等的降低,对细胞活性抑制水平进行检测.嗜热四膜虫突变体生产过剩的黑色素前体成功检测霉菌毒素[8].在“turn on”试验中,一个可定量的分子报告元件与一个特定的基因启动子连接,当受到环境污染物刺激后,细胞能够做出快速响应[8-10].金属硫蛋白基因启动子能够对多种重金属做出快速、灵敏的应激反应.在嗜热四膜虫中,MTT1和MTT3基因的启动子对镉离子的响应敏感,MTT2和MTT4基因的启动子对铜离子的响应敏感,而MTT5基因的启动子对汞离子的响应敏感[11],所以它们能够用于构建不同类型的WCB.荧光素酶因其容易被检测而广泛的用作报告系统[5].

本研究为了获得可以快速检测重金属的WCB,以嗜热四膜虫为材料,构建了一种含有萤火虫荧光素酶基因的重组四膜虫WCB,并检测了该细胞株对重金属镉、汞、铜和锌的响应.

1 材料和方法

1.1 细胞株和质粒

嗜热四膜虫(T.thermophila)B2086细胞株(美国康奈尔大学Peter J.Bruns博士惠赠);质粒pBX(罗彻斯特大学Martin A.Gorovsky教授惠赠),含有HA标签、MTT1启动子、微管蛋白终止子及巴龙霉素抗性基因neo2;大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α为本实验室自行保存,pEASY-T1 Vector购于全式金公司;质粒pGL3-control购自Promega公司.

1.2 试剂和仪器

DNA回收试剂盒(BioFlux公司);质粒抽提试剂盒(BioOMEGA公司);TaqDNA聚合酶和核酸分子量标准(北京TIANGEN公司);PCR引物合成和DNA序列测定由TAKARA公司完成;蛋白胨、酵母提取物、氯化钠和琼脂(上海Sangon公司);氨苄青霉素(华美生物工程公司);萤火虫荧光素酶检测试剂盒E1500(Promega公司);SPP培养基所用示蛋白胨、葡糖糖、酵母提取物、乙二胺四乙酸钠盐(Oxoid公司);青霉素、链霉素、两性霉素(华北制药公司).anti-HA抗体(Cali-Bio公司);HRP标记二抗(Zymed Lab公司);SuperSignal显色液(Pierce公司);GJ-100高压气体基因枪(宁波新芝生物科技公司);GloMaxTM 20/20荧光检测仪(Promega公司).

1.3 方法

分别对pEASY-T1-LUC和载体pBX进行BamH I酶切和AscI双酶切,回收酶切产物中的目的片段LUC和目的载体,按比例混合后用T4 DNA连接酶16℃过夜连接,连接产物转化大肠杆菌DH5а感受态细胞,在含氨苄霉素的LB固体培养基37℃过夜培养,挑取单菌落在LB液体培养基中培养,提取质粒BamH I和XhoI酶切鉴定.

1.3.2 嗜热四膜虫的培养及饥饿 嗜热四膜虫B2086培养在50mL SPP培养液中,生长条件为30℃,180r/min振荡培养;当四膜虫生长至对数生长期(2.0×105～5.0×105个/mL)时,10mmol/L Tris-HCl(pH7.4)洗涤1次,并于50mL 10mmol/L Tris-HCl(pH7.4)中饥饿 18～24h.

1.3.3 四膜虫B2086-LUC的构建及鉴定 构建好的中间载体pBX-LUC用XhoⅠ酶切线性化,并用乙醇纯化浓缩后,包裹在金颗粒上,通过GJ-1000基因枪转入饥饿18～24h的嗜热四膜虫B2086中[12-13],4h后加入巴龙霉素(终浓度为100μg/mL)和 CdCl2(终浓度为 0.5μg/mL),分装到96孔板中,30℃恒温培养3d后,逐步增加巴龙霉素浓度,LUC基因重组入MTT1位点并逐步取代MTT1基因(图1).

图1 载体pBX-LUC与四膜虫大核基因组同源重组示意Fig.1 Schematic diagram of recombination between plasmid pBX-LUC and Tetrahymena macronulear genome

提取嗜热四膜虫基因组,设计引物MTT1F：5′GCTACGTGATTCACGATTTATGCAATG 3′,MTT1R：5′CGAAACTGATTTTATGCAATTAT GAATTAC 3′,PCR扩增鉴定基因的重组效果.

1.3.4 HA-LUC蛋白的免疫印迹法分析 PCR鉴定LUC正确重组的四膜虫细胞在含0,0.1µg/mL镉的 SPP培养基中培养至浓度为(2～3)×105个/mL.收集样品 2×104个细胞并加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(5%β-巯基乙醇,50%甘油,10%SDS和250mmol/L Tris-HCl,pH6.8)后金属浴 95℃加热 5min.将样品在 10%SDSPAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭2h,1：500稀释的anti-HA抗体4℃孵育过夜,1：500稀释的HRP标记的二抗室温孵育1h.经SuperSignal化学发光底物显色液显色3min后检测.

1.3.5 四膜虫B2086-LUC对不同重金属的响应 野生型四膜虫和B2086-LUC培养在50 mL SPP培养液中,生长条件为30℃,180r/min振荡培养.当四膜虫生长至对数生长期(2.0×105～5.0×105个/mL)时饥饿在 10mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)后立即分装5mL/管,分别用终浓度为0,0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5μg/mL 的 CdCl2;0,0.000 5,0.001,0.01,0.05,0.1,0.2μg/mL 的 HgSO4;0,0.25,1,1.25,2,2.5,5mg/mL的CuCl2;0,0.25,1,1.25,2,2.5,5mg/mL的ZnSO4诱导3h.取样后血球计数板记数3次取平均值;每组样品分别取2×105个细胞于灭菌后的1.5mL EP管中,平行对照3组;8000r/min离心5min后,弃尽上清,加入200μL裂解液,重悬混匀;取100μL样品于新的EP管中,同时加入100μL萤火虫荧光素酶底物,荧光检测仪检测并记录荧光值,受试样品3次计数取平均值,计算样品组与对照组荧光值的倍数关系,并绘制荧光值变化倍数-受试样品浓度关系.

2 结果

2.1重组质粒pBX-LUC的鉴定

以克隆载体pGL3-control为模板,扩增萤火虫荧光素酶基因LUC,琼脂糖凝胶电泳检验,PCR产物大小与预期相符(图2A).将PCR产物连接到载体pBX上,重组质粒pBX-LUC经BamH I和XhoI双酶切后,得到大小分别为7kb的载体片段和2.2kb的含有目的基因LUC的片段(图2B),重组质粒pBX-LUC的LUC测序结果与已报道的LUC基因序列进行比对,确证本研究克隆的LUC基因序列正确,表明重组质粒pBX-LUC构建成功.

图2pBX-LUC载体的鉴定Fig.2 Identification of plasmid pBX-LUC

2.2 四膜虫B2086-LUC的鉴定

酶切、浓缩的pBX-LUC转化四膜虫B2086细胞,经同源重组,LUC序列替代大核基因组上MTT1序列(图3A),在不断增加的巴龙霉素浓度下,基因组MTT1序列被LUC逐步替代.挑取在200µg/mL巴龙霉素下存活的B2086细胞株单克隆,扩大培养后提取基因组DNA进行PCR鉴定,阳性细胞株有2条扩增产物,750bp为四膜虫大核基因组MTT1基因序列,2000bp为含有LUC基因序列(图3A),结果表明LUC基因序列部分替代了大核MTT1基因序列,从而证实含有LUC的重组四膜虫B2086-LUC构建成功.

图3 四膜虫pBX-LUC细胞株的鉴定Fig.3 Identification of Tetrahymena B2086-LUC strains

收集PCR鉴定为阳性的B2086-LUC细胞株并提取总蛋白,免疫印迹检测HA-LUC蛋白的表达,结果显示,HA-LUC蛋白分子量大小约为62.82kDa,与软件预测分子量大小相符,而在未经重金属诱导的细胞株中没有出现任何特异性条带(图3B),表明HA-LUC蛋白在四膜虫细胞内表达.

2.3 四膜虫B2086-LUC对重金属的监测

荧光素酶基因是一种重要的报告基因,在应激物诱导时表达产生萤火虫荧光素酶,萤火虫荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素,在荧光素氧化的过程中,会发出生物荧光,然后可以通过荧光测定仪测定荧光素酶催化释放的生物荧光.重组四膜虫B2086-LUC对镉诱导的响应浓度范围为：0.001～0.5μg/mL,峰值为 19891 倍且对应的浓度为0.1μg/mL(图4A);对汞诱导的响应范围为：0.0005～0.2μg/mL,峰值为 1746 倍且对应的浓度为0.05μg/mL(图4B);对铜诱导的响应范围为：0.25～5mg/mL,峰值为2606倍且对应的浓度为2.5mg/mL(图4C);对锌诱导的响应范围为：0.1～5mg/mL,峰值为19463倍且对应的浓度为2mg/mL(图4D).结果说明以四膜虫MTT1基因的启动子启动报告基因萤火虫荧光素酶的表达,可以检测多种应激物的表达,其中对非必需重金属镉、汞最敏感,铜和锌次之.

3 讨论

MT基因在环境中存在重金属时的可诱导性使其可作为一种良好的报告基因.因此,MTs被欧盟列入生物标记物并用于环境评估项目中,其中一种途径是直接检测MT转录或蛋白表达水平,另一种有效途径是将金属诱导型启动子组装到报告基因前,从而构建一个新的转基因生物用于发挥WCB的功能[14-15].类似于其他生物中,四膜虫暴露在金属环境中时MT基因被优先诱导表达[11,16].嗜热四膜虫金属硫蛋白基因MTT1启动子能够被多种重金属离子诱导,因此能够作为潜在的环境污染物的应答元件[9].

迄今为止,85%的用于检测重金属的WCBs是基于遗传学改造的细菌[15],而15%是基于真核生物[17],分别是酿酒酵母、多形汉逊酵母及四膜虫[5,18-19].大多数WCBs只能响应2种或多种金属,而且有些表现出较强的特异性[20-22].其中以重组酿酒酵母为WCB可用于检测样品中的铜污染,最低可检测到0.5μmol/L[19].以重组多形汉逊酵母为载体的WCB主要用于检测环境中的有毒重金属的污染,尤其是镉污染[18].以四膜虫为载体构建的WCB是通过基因重组将萤火虫荧光素酶基因取代BTU2基因,并利用MTT1和MTT5基因启动子的多重响应机制,在生长环境中含有重金属等应激因素时,细胞能够定量检测环境中的污染指数,对非必需重金属(镉,铅,砷和汞)的可检测的最低浓度约为25～50nmol/L,而必须金属(如铜和锌)的可检测的最低浓度约为1μmol/mL[5].本研究获得的重组四膜虫细胞株B2086-LUC对镉、汞也表现出很强的响应,可响应的最低浓度为5～10ng/mL,与已报道的四膜虫WCB的敏感性相近[5].但是本研究将LUC基因取代MTT1基因,而不是四膜虫生长必需的微管蛋白,一方面削弱了MTT1原本的解毒反应,另一方面在不破坏四膜虫微管正常发育的情况下,实现重组细胞株对重金属镉和汞的高敏感性.另外MTT1基因启动子在细胞正常的生理状态下,几乎没有转录产物的出现,而MTT2和MTT4在生理状态下有较高的表达水平,因此MTT1基因启动子的选择有效的减少了荧光的背景信息.B2086-LUC细胞株对铜和锌的响应稍弱,说明其对不同重金属的诱导表现出差异,这与MTT1基因的启动子对不同重金属的敏感性一致.通过多次重复实验证明了B2086-LUC细胞株的稳定性及对重金属污染检测结果的可重复性.

图4 B2086-LUC四膜虫细胞株对不同重金属离子的响应Fig.4 The response to different heavy metal ions in Tetrahymena B2086-LUC cell

获得WCB后用于检测环境污染物,除了需要特定的基因外,它还依赖于测定介质和暴露于诱导物中的时间,以及细胞培养参数如培养浓度和生长阶段等因素,因此建立标准化的操作是必需的.本研究中,重组四膜虫B2086-LUC培养到对数生长期(2.0×105～5.0×105个/mL),饥饿在10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)后立即分装,加入不同浓度的不同受测样品诱导3h,这与已报道的四膜虫WCB的检测方法相似[5].WCB的一个潜在的缺陷是在检测高毒性的样品时,使细胞丧失生存能力并导致假阴性结果的产生,这些样品不仅抑制诱导表达,也同时抑制了报告基因的本底表达,本研究通过稀释样品恢复本底和诱导反应,从而实现有效检测.因此,系列稀释诱导的WCB的荧光表达不仅可以用于检测高毒性样品引起的假阴性,还可以用于识别潜在的假阳性.本研究中的工程化细胞株基于MTT1基因的启动子对一些重金属离子(如镉,汞)具有的偏爱性,因而具有特定的监测优势.因此重组萤火虫荧光素酶的四膜虫B2086-LUC可望作为一种良好的环境污染监测工具用于环境中镉、汞的快速监测.

4 结论

4.1 重组过表达载体pBX-LUC成功构建,其中含有LUC基因,MTT1基因启动子,HA标签,neo2抗性基因.

4.2 构建含有LUC的WCB重组四膜虫B2086-LUC细胞株,LUC基因部分取代MTT1基因,在重金属诱导下LUC蛋白特异表达.

4.3 B2086-LUC对重金属镉和汞的响应最敏感,可检测的最低浓度为5～10ng/mL;对铜和锌的响应较弱,可检测的最低浓度为0.5～1mg/mL.

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致谢：重组四膜虫的构建由王清路博士及梁海霞博士协助指导完成,在此表示感谢.