硝酸银对根癌农杆菌介导的木薯遗传转化的影响

郭运玲 尹奇 孔华 黄启星 左娇 贺立卡 郭安平

（中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101）

木薯（Manihot esculantaCrantz）属大戟科（Euphorbiacae）木薯属（Manihot），为多年生灌木，是世界三大薯类作物之一。全球种植面积1 700余万hm2，仅次于马铃薯，大于甘薯，广泛分布于南、北纬30之间，不仅为全球超过5亿人提供基本的食物，而且是热带、亚热带重要的热能来源［1］。由于木薯是杂合体，遗传背景复杂，采用常规育种的方法改良品种和提高产量很难达到预期的效果。生物技术作为一种强有力的工具，能有效地弥补传统育种方法的不足，打破物种间的界限，在不改变作物原有特性的基础上，能将一些具有重要农艺性状的基因（如抗病、耐寒以及与产量、品质相关基因等）导入其中，从而实现品种改良的目的。但是，许多植物的遗传转化研究中存在的再生困难问题严重制约了转基因技术的广泛应用［2］。因此如何提高转化效率是木薯及其他作物遗传转化中的一个关键问题。

硝酸银曾作为一种杀菌剂，应用于植物组织培养的表面消毒［3］。近年来，在植物组织培养中，添加硝酸银可以促进愈伤组织及芽器官发生、体细胞胚胎的形成以及离体植株的再生，这在许多单子叶、双子叶植物中已有研究［4］。有研究者将硝酸银应用于植物遗传转化上，以提高外源基因的转化效率。例如，在水稻［5］、黑麦草［6］、油菜［7］，香蕉［3］，大豆［8］、桑树［9］等作物的转化研究中用到硝酸银，结果显示硝酸银在这些作物的遗传转化中具有促进作用。张鹏和姚庆荣［10，11］也对几个木薯品种的器官发生和植株形成进行过研究，发现硝酸银有促进芽器官的发生和抑制愈伤的形成。但是到目前为止，还没有关于硝酸银对木薯子叶经农杆菌处理后对不定芽诱导影响的报道。本研究以目前生产上的主栽木薯品种华南8号（SC8）胚状体子叶为外植体，比较硝酸银对经农杆菌侵染和未经农杆菌侵染的外植体的不定芽诱导的影响，研究硝酸银在农杆菌介导的木薯遗传转化中的作用，旨在为建立高效的木薯遗传转化体系打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为SC8，由中国热带农业科学院品种资源研究所提供，本实验室试管苗保存。以成熟培养10-15 d的初生或次生胚状体子叶作为外植体。

1.2 方法

1.2.1 农杆菌工程菌株及菌液的制备 农杆菌工程菌株GV3101，内含质粒pRNAiSIII（本实验室构建保存）。挑取保存的农杆菌单菌落接种于25 mL含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃，200 r/min培养24-36 h至对数生长期，将培养好的菌液在5 000 r/min，常温下离心10 min，收集菌体重悬于MS液体培养基中，使其菌液浓度达到OD=0.5-1.0备用。

1.2.2 培养基配置 不定芽诱导培养基为MS基本培养基上添加1 mg/L 6BA，0.5 mg/L CuSO4，2%蔗糖和6 g/L琼脂粉，pH5.8。根据试验需要添加不同浓度的硝酸银（0、2、4、6、8和 10 mg/L 6个处理）。

1.2.3 未经农杆菌处理的硝酸银作用试验 将准备好的SC8胚状体子叶接种在含不同浓度硝酸银的不定芽诱导培养基中，培养条件为28℃，光照12-14 h/d，光照强度1 500-2 000 Lx。7 d继代一次，每皿接种50个外植体，每个处理接种3皿，重复2次。20 d后统计愈伤组织和不定芽生长情况。

1.2.4 经农杆菌处理后硝酸银的作用试验 将准备好的SC8胚状体子叶放入制备好的农杆菌工程菌液中侵染30-45 min，倒掉菌液，并将外植体上多余菌液吸干，接种到不加Kan的不定芽诱导培养基上共培养3 d。然后将外植体上的菌体用无菌水冲洗2-3次，最后一次加入适量羧苄青霉素，直到将菌体全部洗净，用无菌滤纸将外植体上多余水分吸干。接种到加有Kan抗性筛选和不同浓度硝酸银的不定芽诱导培养基上。7 d继代一次。每皿接种50个外植体，每处理接种3皿，重复2次。20 d后统计愈伤组织和不定芽生长情况。

1.2.5 硝酸银处理时间对不定芽的影响试验 硝酸银添加的时间设置两个处理（A、B），A处理为20 d，即外植体在添加有硝酸银的不定芽诱导培养基上生长20 d后，其他培养条件不变，将外植体转接到去除硝酸银的不定芽诱导培养基上继续培养7 d。B处理是在不定芽的诱导生长整个过程中都添加硝酸银。

1.2.6 外植体上不定芽和愈伤组织的统计方法 参考Zhang［10］2001年的方法并稍作修改。

不定芽的发生率分3个级别统计，分别用OD1（organogenesis degree）、OD2、OD3表示。OD1每个外植体上不定芽的分化为3个以下植株所占的百分比；OD2每个外植体上不定芽的分化为 3-5个植株所占的百分比；OD3 每个外植体上不定芽分化 5个以上植株所占的百分比；它们之和为每个处理的不定芽发生率SO（shoot organogenesis）。

愈伤组织的发生率也分3个级别统计，分别用CD1（callus degree）、CD2、CD3表示。CD1每个外植体上愈伤组织直径小于0.25 cm植株所占的百分比；CD2每个外植体上愈伤组织直径在0.25-0.5 cm植株所占的百分比；CD3愈伤组织直径大于0.5 cm植株所占的百分比，它们之和为每个处理的愈伤组织发生率CF（callus formation）。

2 结果

2.1 硝酸银对未经农杆菌处理的木薯子叶愈伤及不定芽诱导的影响

由表1和表2及图1可知，未经农杆菌处理的木薯SC8胚状体的子叶，由于硝酸银浓度的不同，对外植体不定芽发生的影响不同。我们观察到在不加硝酸银的不定芽诱导培养基中，子叶切口处产生了大量黄色致密的愈伤组织，愈伤组织形成率达到100%；不定芽发生率较低，为 58.5%，主要以单芽分化为主。随着硝酸银浓度的增加，不定芽发生随之增加，愈伤组织形成减少，当浓度为6 mg/L时，不定芽发生率达到最高，为 87.5%，每个外植体上的不定芽数目也相应增加，有些甚至达到6-7个。研究表明，添加适宜浓度的AgNO3，不仅可以大大提高不定芽的发生，而且可以明显降低愈伤组织的形成。我们还可以看出，在不同浓度的硝酸银处理中，愈伤组织形成随AgNO3浓度的升高而降低，当AgNO3浓度达到6 mg/L时，子叶切口周围产生的愈伤较少；当浓度大于6 mg/L，达到8和10 mg/L时，愈伤组织受到明显抑制，几乎没有愈伤形成，但不定芽发生也未因此而升高，相反呈下降趋势。因此，对木薯SC8而言，在不定芽诱导培养基中，添加6 mg/L硝酸银，即可获得最佳的不定芽诱导效果。

表1 不同浓度的硝酸银对未经农杆菌处理外植体不定芽分化的影响

表2 不同浓度的硝酸银对经农杆菌处理外植体愈伤组织形成的影响

图1 硝酸银对未经农杆菌处理的SC8外植体不定芽诱导和愈伤组织形成的影响

2.2 硝酸银对经农杆菌处理的木薯子叶愈伤及不定芽诱导的影响

由表3、表4和图2可以看出，经农杆菌处理后的木薯SC8胚状体子叶，我们观察到在不加硝酸银的不定芽诱导培养基中，每个子叶切口处都有淡黄色愈伤组织的形成，愈伤组织大有多；不定芽发生少，外植体上基本以单个芽分化为主。随着硝酸银浓度的增加，不定芽发生随之增加，而愈伤组织反而减少。这与未经农杆菌处理的研究结果大体一致。只是硝酸银的浓度为8 mg/L时，不定芽发生率达到最高，为85.3%，每个外植体上的不定芽数目也有所增加，多的可达5个以上。当硝酸银浓度达到10 mg/L，愈伤组织基本很少，但不定芽的分化反而锐减，说明硝酸银的浓度并非越高越好，对木薯SC8而言，经农杆菌侵染后外植体不定芽的分化以添加硝酸银浓度8 mg/L为适宜。

表3 不同浓度的硝酸银对经农杆菌处理的外植体不定芽分化的影响

表4 不同浓度的硝酸银对经农杆菌处理后外植体愈伤组织形成的影响

图2 硝酸银对经农杆菌处理的SC8外植体不定芽诱导和愈伤组织形成的影响

2.3 硝酸银的处理时间对愈伤及不定芽的影响

图3 硝酸银处理时间对不定芽的影响

从图3可以看出，处理A（20 d）诱导出来的不定芽生长正常，处理B（全程）诱导出来的不定芽生长不正常，芽发生畸形变异。所以，硝酸银作为不定芽的促进剂不能长时间添加，添加的时间太长，不但对芽的诱导没有促进作用，反而使诱导出的芽发生畸形变异。硝酸银对木薯SC8子叶不定芽诱导的处理时间以20 d比较适宜。

3 讨论

AgNO3作为乙烯合成抑制剂，可有效降低植物细胞在离体培养中乙烯的积累，从而促进外植体的生长和不定芽分化。在植物离体培养时，培养基中添加AgNO3，可以明显促进器官发生、体细胞胚胎形成和完整植株的再生。在许多单子叶和双子叶作物上得到证明和应用［12-15］。

许多研究在建立植物遗传转化技术体系时都对培养基上添加硝酸银的最适浓度进行筛选［10，11］，但是这种筛选一般是在外植体未被农杆菌处理的情况下进行的，当外植体被农杆菌处理后受到的胁迫增加，外植体内的乙烯含量从理论上来说也会相应增加，那么在后期的筛选培养基上所加硝酸银浓度是否会随之发生变化，而且硝酸银对农杆菌转化到底有无影响，这一问题往往被忽视。本研究从该问题着手，比较研究了硝酸银对未经农杆菌处理和经农杆菌处理后的木薯子叶不定芽诱导的影响，结果发现硝酸银对二者的影响基本一致，只是经农杆菌侵染后所需硝酸银的最适浓度为8 mg/L，高于未经农杆菌处理的芽诱导所需硝酸银最适浓度6 mg/L。这可能与外植体所受的胁迫不同有关，经农杆菌处理过的外植体所受胁迫不但有机械损伤，还有农杆菌的侵染、筛选抗性标记卡纳霉素和抑菌剂羧苄青霉素的影响，需要更多的银离子来抑制乙烯的作用。

硝酸银添加的浓度、方式及时间，从其他作物的研究结果来看，硝酸银使用的浓度一般是1-10 mg/L。浓度太高，对外植体会产生毒性作用［4］。同时应注意适宜的AgNO3浓度，外植体长期培养于含AgNO3的培养基中也易导致再生植物畸形而影响再生率。Palmer［16］将培养12 d的外植体转接到不含硝酸银的培养基上，能促进不定芽的数目。Sharma等［17］认为，培养物最少应在含硝酸银的再生培养基上培养11 d，张鹏［12，13］认为硝酸银使用时间长短跟芽原基的形成时间有关，一般在芽原基形成后即可去除硝酸银，不同植物不同品种对硝酸银的反应不同。与前人研究结果相同，木薯SC8子叶芽的诱导和形成不能在添加硝酸银的培养基上长期生长，以在添加硝酸银芽诱导培养基上生长20 d较适宜，这时能有效促进芽的分化和生长。若时间过长，对不定芽的形成没有促进作用，反而会使已形成的芽发生畸形变异而影响再生率。

4 结论

本研究以成熟培养10-15 d华南木薯SC8品种的胚状体子叶为外植体，研究硝酸银在根癌农杆菌介导的木薯遗传转化。结果表明，硝酸银对木薯SC8胚状体子叶愈伤形成有明显抑制作用，对其遗传转化有促进作用。

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