水杨酸钠致耳鸣大鼠的行为学及听性脑干反应改变*

陈抗松 廖华 杨希林 陈建新 解为全 吴莎

耳鸣是耳科临床最常见的症状之一，耳鸣与心理因素密切相关，严重耳鸣可能使患者产生烦恼、焦虑、抑郁等不良情绪且在无意识中不断增强，继而耳鸣被感知为令人厌烦的信号，使精神紧张或抑郁加剧并形成恶性循环的条件反射[1]。为了研究耳鸣产生的机制，Jastreboff最先提出了经典的水杨酸致耳鸣动物模型，之后大量研究证实此动物模型用于耳鸣研究是可行的[2，3]。为了解耳鸣对精神行为的影响，本实验采用目前动物精神心理研究中最常用的行为学方法[4]评估水杨酸致耳鸣大鼠模型的抑郁焦虑行为改变，并观察其听力的变化，报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物分组及处理 通过旷场实验[4]，选取行为学指标得分相近、耳廓反应灵敏的18只成年Wistar雄性大鼠为实验动物，体重200～280 g，由武汉大学人民医院实验动物中心提供。动物随机分为对照组、水杨酸组和盐水组，每组6只。对照组不予处理，水杨酸组每天上午8：00给予350 mg/kg[2，3]水杨酸钠(购自Sigma公司)腹腔注射1次，共注射28天，盐水组每天同一时间腹腔注射相同剂量的生理盐水，共注射28天。

1.2实验方法

1.2.1动物耳鸣的行为学检测 参照Jastreboff[4]经典验证动物耳鸣的饮水抑制法，并在此基础上将足部电击改为嘴部电击。在大鼠形成“声音出现-饮水开始，声音消失-饮水停止”的条件反射后停止训练并开始注射水杨酸钠，条件反射消退期1～3天测量饮水抑制率(R)，R=B/(A+B),其中B为条件刺激(背景噪声停止)期1 min内大鼠的饮水次数，A为条件刺激之后1 min内大鼠饮水次数。

1.2.2旷场行为学测量 旷场实验(可反映动物的抑郁焦虑行为)参照Elliott等[5]的方法，自制大小为120 cm×90 cm×35 cm的旷场，四周和底壁均为黑色，底壁等分为9个40 cm×30 cm的方格，位于正中的为中央格，于上午8：00～12:00在安静、光线及温度适宜的房间内进行观察。使用动物行为自动跟踪系统(Ethovision3.0,荷兰)记录并分析大鼠在旷场内10 min的总行程、平均速度、直立次数(动物双前足离开底面为标志，无论动物站立多长时间直至放下双前足为1次)、中央格停留时间及粪便粒数。在造模前1天、第14、28天对每只动物进行检测，每只大鼠检测时将其置于中央格内，完毕后清理旷场内的粪便，用75%的酒精彻底清洁消毒旷场，待酒精挥发后，再进行下一只测试。

1.2.3体重及摄食量的变化 在造模第28天称取各组大鼠的体重及24 h摄食量，减去造模前一天的体重和摄食量为各组大鼠的体重和摄食量的改变。

1.2.4糖水偏爱实验 参照Willner[6]的方法，在造模前1天和第28天进行糖水偏爱实验。实验前24小时在安静的房内，每笼(单笼喂养)同时给两个均装有1%蔗糖水的小瓶训练动物饮用糖水；随后24小时，每笼再同时给两小瓶水，一瓶装1%蔗糖水，一瓶装纯净水；禁食水24小时后再同时给每只大鼠定量好的两小瓶水，一瓶为1%蔗糖水，一瓶为纯净水，1小时后取走小瓶并称重，记录动物的糖水消耗、纯水消耗并计算糖水偏爱[糖水消耗/(糖水消耗+纯水消耗)×100%]。

1.2.5ABR测试 注射水杨酸钠前1天、注射第7、14、28天，在旷场检测完成后对水杨酸组大鼠在屏蔽隔声室内行ABR测试。按45 mg/kg剂量腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后置于固定架上，记录电极插于大鼠耳间线中点颅顶皮下，参考电极插于给声耳乳突皮下，地线插于鼻尖，采用TDT(美国TDT公司)系统SigGenRP软件单耳给声并采集信号，刺激声为click，强度范围为10～110 dB SPL，衰减间隔5 dB，滤波带宽300～3 000 Hz，持续时间10 ms，叠加1 024次，记录ABR的反应阈及80 dB SPL时各波的潜伏期和波间期。

1.3统计学方法 采用SPASS17.0统计软件，两独立样本的计量资料采用t检验；重复测量的计量资料采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠耳鸣行为学检测结果 经过5天的适应性训练，三组大鼠的饮水抑制率均小于0.2，且R值趋于稳定，条件反射消退期1～3天水杨酸组大鼠的R值明显高于对照组和盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明本实验耳鸣动物模型造模成功。

2.2各组大鼠旷场行为的改变(表1) 实验前各组大鼠的旷场行为(运动总行程、速度、直立次数、中央格停留时间、粪便数量)差异均无统计学意义(P>0.05)。第14天，水杨酸组与其它两组比较，其运动总行程、平均速度和直立次数均减少，粪便粒数增加，差异有统计学意义(P<0.05)，中央格停留时间差异无统计学意义(P>0.05)；盐水组与对照组比较，各旷场行为差异均无统计学意义(P>0.05)。第28天，水杨酸组与其它两组比较，旷场行为差异均有统计学意义(均P<0.01)，盐水组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3注射水杨酸钠第28天各组大鼠体重、摄食量、24 h液体消耗量、糖水偏爱的改变(表2) 水杨酸组与盐水组和对照组比较，大鼠的体重增长缓慢，摄食量减少，24 h液体消耗量减少，对糖水的偏爱减低，差异均有统计学意义(P<0.05)；盐水组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4水杨酸组大鼠ABR的改变(表3) 水杨酸组大鼠注射水杨酸钠前ABR反应阈为36.67±4.08 dB SPL，注射第7天，各波潜伏期和波间期与注射前相比稍延长，但差异无统计学意义(P>0.05)；注射第14天与注射前和第7天比较，波Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ潜伏期均延长，差异有统计学意义(P<0.05)，而各波间期差异无统计学意义(P>0.05)；注射第28天与注射前和第7天比较，各波潜伏期及Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波间期延长，差异有统计学意义(P<0.05)，而Ⅰ-Ⅲ波间期差异无统计学意义(P>0.05)，与第14天比较，各波潜伏期和Ⅰ-Ⅲ波间期差异无统计学意义(P>0.05)，而Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波间期差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠不同时间旷场行为的比较

注：*与对照组和盐水组同期比较，P<0.05

表2 注射水杨酸钠第28天各组大鼠体重、摄食量、总液体消耗量、糖水偏爱的比较

注：*和盐水组与对照组比较，P<0.05

表3 水杨酸组大鼠水杨酸钠注射前后ABR各波潜伏期、波间期和反应阈的比较

注：#与注射前比较，P<0.05;△与注射第7天比较，P<0.05;*与注射第14天比较，P<0.05

3 讨论

长期耳鸣可能会引发患者抑郁、焦虑、记忆力减退等症状，邵茵等[7]采用汉密顿焦虑量表和汉密顿抑郁量表对1 240例耳鸣患者的临床表现进行统计分析，其中有不良心理反应者占89.6%，心情烦躁者占83.8%，影响睡眠者占63.7%，注意力难以集中者占30.3%；方祎等[8]用劳拉西泮(一种常用的苯二氮卓类抗焦虑药)结合耳鸣咨询与声治疗，发现其可显著改善耳鸣患者的耳鸣症状和焦虑情绪，支持Jastreboff提出的耳鸣神经生理学模型；孙华等[9]使用抗抑郁药氟西汀治疗不伴听力损失的耳鸣患者，证实氟西汀可使耳鸣的疗效明显提高，伴随抑郁情绪的显著改善，提示耳鸣与抑郁之间有一定的关联，可能有共病现象存在。

目前精神心理研究的动物实验中常以旷场实验、糖水偏爱实验评估动物的抑郁焦虑行为变化，以判断是否产生精神行为异常。旷场实验是指通过观察动物(尤其是啮齿类动物)进入到一个四周封闭的空旷场地中产生的行为变化，研究其情绪的过程，由Hall于1934年首次提出并应用于情绪方面的研究，目前已发展成为动物心理学方面尤其是抑郁、焦虑方面最常用评估方法之一[10]。中央格停留时间反映动物对环境的认知能力，正常动物会避开空旷环境，迅速离开中央格，沿周边活动，如果对新环境的认知能力较差，则停留在中央格的时间延长[10]。从文中结果看，随着用药时间的延长，三组大鼠中央格停留时间缩短，可能与动物对旷场的适应有关，但水杨酸组大鼠注射第28天中央格停留时间明显延长(P<0.05)，说明长期注射水杨酸对大鼠的认知能力产生了一定影响；水平活动和垂直活动反映动物的探索行为、兴奋性和运动水平，水杨酸组与正常组和盐水组比较，总行程和平均速度显著下降(P<0.05)，而盐水组与对照组比较，所有旷场行为指标均无显著差异(P>0.05)，表明腹腔注射生理盐水对大鼠的行为影响非常小，而注射水杨酸对大鼠的探索性、兴奋性及运动性产生一定的抑制作用；糖水消耗量、糖水偏爱百分比是测量抑郁症模型动物快感缺乏的有效客观指标，动物总的液体消耗量不变而糖水饮用量下降说明动物对幸福事件反应能力下降[11]，本实验结果与抑郁症大鼠模型的糖水偏爱实验结果[10]接近。总之，本实验中的水杨酸组大鼠与对照组相比，糖水消耗减少，在规定时间内水平活动、垂直活动减少，侵犯攻击能力下降、摄食减少、体重增长减缓等与抑郁症者的精神运动改变、兴趣或快感缺失有一定的相似性，说明耳鸣可能引起焦虑、抑郁，因此，以上行为学观察方法在一定上程度上反映了耳鸣对生物体情绪的影响。

有研究提示，不伴听力损失的耳鸣患者的ABR各波潜伏期延长[12]；Barnea等[13]认为ABR对于耳鸣的诊断无意义，而Lemaire等[14]发现耳鸣患者ABR波Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波幅下降和波间期延长，且与听力损失的程度无关；Liu等[3]对注射水杨酸大鼠行ABR检测，发现多次注射水杨酸钠的大鼠ABR各波波幅下降，且随着注射水杨酸钠的时间延长其ABR反应阈不断上升，各波潜伏期不断延长。本实验中，腹腔注射水杨酸第14、28天，水杨酸组大鼠各波潜伏期和波间期均显著延长(P<0.05)，且以波Ⅴ的改变最显著(P<0.01)，而注射水杨酸第7天与实验前比较无明显改变，表明长期注射水杨酸钠可导致大鼠外周听觉神经至脑干通路的神经电活动异常，但这种改变是否是耳鸣产生的原因有待进一步的研究。

目前关于耳鸣与精神行为异常的关系已成为研究热点，但其发生机制尚不清楚，本实验将评估动物精神心理异常的行为学方法应用于耳鸣动物模型的研究，对耳鸣大鼠模型的旷场行为进行了详细的记录和分析，为耳鸣与精神心理异常关系的研究提供了动物实验基础，下一步将在分子生物学方面对大鼠耳鸣与精神异常的关系进行探讨。

4 参考文献

1 Jastreboff PJ. Tinnitus retraining therapy[J]. Prog Brain Res,2007,166:415.

2 贾明辉,秦兆冰.耳鸣动物行为学模型的制作[J].听力学及言语疾病杂志,2007,15:73.

3 Liu XP,Chen L.Auditory brainstem response as a possible objective indicator for salicylate-induced tinnitus in rats [J] .Brain Res,2012,1485:88.

4 Jastreboff PJ,Brennan JF,Coleman JK,et al.Phantom auditory sensation in rats:an animal model for tinnitus[J].Behavior Neuroscience,1988,102:811.

5 Elliott PJ,Chan J,Paker YM,etal.Behavioral effects of neurotensin in the open field:structure-activity studies[J].Brain Research,1986,381:259

6 Willner P．Chronic mild stress(CMS) revisited：consistency and behavi-neurobiologicalaural concordance ineffects of CMS[J]. Neuropsychobiology,2005,52:90.

7 邵茵,黄娟,李明.1 240例耳鸣患者的临床表现分析[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2009,44:641.

8 方祎，马芙蓉，赵一鸣，等.声治疗联合劳拉西泮治疗耳鸣的临床研究[J].听力学及言语疾病杂志,2012,20:420.

9 孙华,陈平.氟西汀参与耳鸣治疗的意义[J].听力学及言语疾病杂志,2005,13:91.

10 Yang C,Wang G, Wang H, et al.Cytoskeletal alterations in rat hippocampus following chronic unpredictable mild stress and re-exposure to acute and chronic unpredictable mild stress[J].Behav Brain Res ,2009 ,205:518.

11 Cho JH,Johnson GVW.Primed phosphorylatiorylation of tau at Thr231 by glycogen synthase kinase 3beta(GSK3beta)plays a critical role in regulating tau，s ability to bind and stabilize microtubules[J]. Neurochem,2004,88:349.

12 刘淑芳,杜宝东,郭晓峰，等.无听力损失耳鸣患者听性脑干反应检测及意义[J].临床耳鼻咽喉科杂志,2000,14:322.

13 Barnea G, Attias J, Gold S,et al. Tinnitus with normal hearing sensitivity : extended high - frequency audiometry and auditory - nerve brain- stem- evoked responses[J ] . Audiology,1990,29:36.

14 Lemaire MC , Beutter P. Brainstem auditory evoked responses in patients with tinnitus[J ] . Audiology , 1995,34:287.