EZH2和CBX7在皮肤血管瘤中的异常表达及意义

唐 甜 陈小希 张端莲

（1武汉大学人民医院肿瘤Ⅱ科 湖北430060；2湖北省地质职工医院 武汉430072；3武汉大学基础医学院组织胚胎教研室 湖北430071）

血管瘤是婴幼儿最常见的良性血管肿瘤，它是一种由血管形成异常而引起的疾病，其特点是通过未成熟的内皮细胞弥散增殖而在出生后快速生长，之后自发消退。血管内皮细胞异常增殖是血管瘤的主要组织学特点［1－3］。虽然大多数血管瘤能自发消退，但是一些血管瘤病变严重损坏正常组织，产生并发症。目前的治疗方法的成效很有限，一些治疗方法的副作用也限制了其应用。深入研究和了解血管瘤的发病机理将为治疗血管瘤提供更好的治疗手段。

EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是果蝇zeste基因增强子（E（z））的人类同源物，是PcG（Poly comb Group）基因家族的重要成员之一。在PcG基因家族中，EZH2起着核心作用。目前已在多种恶性肿瘤组织中发现EZH2表达增高，包括乳腺癌、膀胱癌、肝癌等，并发现EZH2高表达与肿瘤的进展和预后差相关［4，5］。CBX7（ehromobox homolog 7）与黑腹果蝇的异染色质蛋白（Heteroehromatin Protein，HPI）具有同源性，主要分布于染色质、核，其分子功能通过与染色质结合实现。目前已有研究表明CBX7在肿瘤细胞中有表达［6］。

本文通过应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤组织中EZH2和CBX7的表达水平，以探讨其在血管瘤发生、发展过程中的作用机制，为临床上治疗血管瘤提供更多参考和指导。

材料和方法

1.材料

1.1 材料来源

收集武汉大学人民医院病理科2005年9月－2009年12月皮肤毛细血管瘤存档蜡块50例，其中男性25例，女性25例。这些血管瘤所在的部位有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。

1.2 材料分组

将所有标本进行常规HE染色和免疫组织化学S－P法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按Mulliken分类标准并结合PCNA的表达进行分组：石蜡标本中增生期血管瘤26例，退化期血管瘤24例。另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。

1.3 主要试剂

即用型鼠抗人EZH2和CBX7单克隆抗体（购于北京中杉生物技术有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（购于福州迈新公司）；DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸（购于北京中杉生物技术有限公司）。

2.方法

2.1 常规脱水、透明、石蜡包埋、切片及HE染色

2.2 免疫组织化学SP法检测EZH2和CBX7相关抗原

2.2.1 具体步骤：

（1）4μm组织切片常规脱蜡入水；（2）抗原修复（柠檬酸缓冲液微波抗原修复法）；（3）滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景；（5）分别滴加一抗；（6）滴加链霉素抗生物素蛋白－过氧化物复合物37℃湿盒孵育；（7）滴加新鲜配置的DAB显色液显色；（8）苏木素复染；（9）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检；（10）用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为EZH2和CBX7的阳性对照组。

2.2.2 免疫组织化学结果判断

（1）EZH2和CBX7都是以胞核或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对EZH2和CBX7的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）

3.统计学处理

数据以均数±标准差表示，用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK（q）检验，检验水准α为0.05。

结 果

1.EZH2的表达

增生期血管瘤内皮细胞或胞质内有较多棕黄色颗粒，EZH2表达强（图1）；退化期血管瘤内皮细胞核或胞浆内有较少棕黄色颗粒，EZH2表达弱或无表达（图2）；正常皮肤组血管内皮细胞核或胞浆内有较少棕黄色颗粒，EZH2表达弱或无表达（图3）。图像分析结果见表1。增生期组EZH2的表达明显高于退化期组和正常皮肤组 （P＜0.05），而后两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 血管瘤不同时期EZH2表达的平均光密度和阳性面积率（±s）Table 1 The average optical density and the rate of EZH2 positive area of in period of human dermal hemangiomas±s）

表1 血管瘤不同时期EZH2表达的平均光密度和阳性面积率（±s）Table 1 The average optical density and the rate of EZH2 positive area of in period of human dermal hemangiomas±s）

＊增生期组与退化期组比较，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期组与正常皮肤组比较，P＞0.05；（Comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常皮肤组与增生期组比较，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue）▲P＜0.05

组别Group例数N平均光密度Average Optical Density阳性面积率Rate of Positive Area增生期组Proliferating Group 26 0.3201±0.0056＊ 0.3650±0.0058＊退化期组Involuting Group 24 0.0584±0.0026△ 0.0815±0.0029△正常皮肤组Normal Skin Group 5 0.0520±0.0024▲ 0.0793±0.0027▲

2.CBX7的表达

增生期血管瘤内皮细胞核或胞质内有较多棕黄色颗粒，CBX7表达强（图4）；退化期血管瘤内皮细胞胞核或胞质内有较少棕黄色颗粒，CBX7表达弱或无表达（图5），正常皮肤组血管内皮细胞核或胞浆内有较少棕黄色颗粒，CBX7表达弱或无表达（图6）。图像分析结果见表2。增生期血管瘤内皮细胞的表达显著高于退化期血管瘤内皮细胞和正常皮肤组（P＜0.05），而后两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 血管瘤不同时期CBX7表达的平均光密度和阳性面积率（±s）Table 2 The average optical density and the rate of CBX7 positive area of in period of human dermal hemangiomas（±s）

表2 血管瘤不同时期CBX7表达的平均光密度和阳性面积率（±s）Table 2 The average optical density and the rate of CBX7 positive area of in period of human dermal hemangiomas（±s）

＊增生期组与退化期组比较，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期组与正常皮肤组比较，P＞0.05；（Comparison between involuting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常皮肤组与增生期组比较，P＜0.05；（Comparison between proliferating hemangiomas and normal skin tissue）▲P＜0.05

组别Group例数N平均光密度Average Optical Density阳性面积率Rate of Positive Area增生期组Proliferating Group 26 0.3014±0.0049＊ 0.3593±0.0052＊退化期组Involuting Group 24 0.0675±0.0027△ 0.0751±0.0030△正常皮肤组Normal Skin Group 5 0.0601±0.0025▲ 0.0721±0.0029▲

讨 论

皮肤血管瘤是常见的血管肿瘤之一，以毛细血管内皮细胞异常增殖为主要组织学特点。大多数血管瘤的生长经历三个时期，即增生期、退化期及退化完成期。增生期是在血管瘤发病初期几个月内，表现为内皮细胞过度增殖，以大量毛细血管内皮细胞快速增殖和血管异常形成为典型特征；随后，增殖期血管瘤进入漫长的退化期，该期血管瘤内皮细胞出现大量凋亡，细胞外基质纤维和脂肪组织增生，替代血管瘤增生组织；退化期持续约数月到数年，而后进入退化完成期［7－8］。

一般认为，血管瘤是血管生长及修复的紊乱，其主要的特征是毛细血管的内皮细胞增生。这也与肿瘤发生发展的机制，即细胞增殖失控、分化障碍及凋亡受阻等相一致［9］。

EZH2基因是1996年发现的一种新的人类基因，EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是果蝇基因增强子（E（z））的人类同源物，是PcG家族的重要成员之一。作为一种重要的PcG蛋白，EZH2参与染色质结构的形成、基因表达调节以及生长控制。大量研究证据支持EZH2与肿瘤的发生、发展密切相关［10－12］。目前已在多种恶性肿瘤组织中发现EZH2表达增高，包括乳腺癌、膀胱癌、肝癌等，并发现EZH2高表达与肿瘤的进展和预后差相关。体外研究亦支持EZH2在肿瘤的发生、发展中起重要作用［13－15］。

Chromobox 7（CBX7）蛋白是Poly Colnb家族一员；Polycomb group（PcG）蛋白家族是基因调控决定细胞命运的组成部分，它被认为能通过下调INK4a／ARF肿瘤抑制因子的表达控制细胞增殖，它的紊乱能够导致肿瘤发生［16－17］。CBX7（ehromobox homolog 7）主要分布于染色质、核，其分子功能通过与染色质结合实现。目前已有研究表明CBX7在肿瘤细胞中有表达，但不同肿瘤中CBX7表达情况与肿瘤的恶性程度的关系有不同表现，部分肿瘤CBX7高表达提示肿瘤恶性程度高，在另外的肿瘤则相反［18－20］。

实验采用免疫组织化学方法对EZH2和CBX7在50例人皮肤血管瘤组织中的表达进行了检测。本实验结果显示：在增生期血管瘤内皮细胞中EZH2的含量明显高于退化期和正常皮肤组织 （P＜0.05），这提示了EZH2作为一个新的癌基因，在血管瘤的增殖期高表达，表现为刺激血管瘤内皮细胞增殖和肿瘤形成。这一过程分别受到肿瘤细胞转移促进相关基因和转移抑制相关基因的调控。而CBX7在增生期血管瘤内皮细胞中也呈高表达，提示CBX7与肿瘤细胞的异常增殖密切相关，推测其可能成为预测肿瘤预后的分子标记物和潜在治疗靶点。我们并且分析EZH2和CBX7在增生期血管瘤组织中都呈高表达，两者关系密切，在EZH2蛋白高表达的组织中CBX7组织也呈高表达。提示EZH2和CBX7可能共同促进血管瘤的发生和发展。

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图 版 说 明

图1 增生期血管瘤EZH2的表达 内皮细胞胞浆内有较多棕黄色颗粒（→），EZH2表达强，S－P×200

图2 退化期血管瘤EZH2的表达 内皮细胞胞浆内有少量棕黄色颗粒（→），EZH2表达弱，S－P×200

图3 正常皮肤组织EZH2的表达 正常皮肤组织血管内皮细胞核或胞质内有少量的棕黄色颗粒（→），EZH2表达弱，S－P×200

图4 增生期血管瘤CBX7的表达 内皮细胞胞浆内有较多棕黄色颗粒（→），CBX7表达强，S－P×200

图5 退化期血管瘤CBX7的表达 血管瘤内皮细胞胞核或胞质内有较少棕黄色颗粒，CBX7表达弱或无表达（→），S－P×200

图6 正常皮肤组织CBX7的表达 正常皮肤组织血管内皮细胞核或胞质内有少量的棕黄色颗粒（→），CBX7表达弱，S－P×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 EZH2 expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of pro－liferating endothelial cells，EZH2 expressed strongly（→）.S－P×200

Fig.2 EZH2 expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，EZH2 expressed weakly（→）.S－P×200

Fig.3 EZH2 expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，EZH2 expressed weakly（→）.S－P×200

Fig.4 CBX7 expression in proliferating hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of proliferating endothelial cells，CBX7 expressed strongly（→）.S－P×200

Fig.5 CBX7 expression in involuting hemangioma.There were few brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells，CBX7 expressed weakly（→）.S－P×200

Fig.6 CBX7 expression in normal skin Group.There were few brown particles in cytoplasm the of in normal skin endothelial cells，CBX7 expressed weakly（→）.S－P×200