CyclinE和p27蛋白在骨肉瘤中的表达及临床意义

鲍正齐 肖玉周 张长春 吴 敏 李永昊 周建生

（蚌埠医学院第一附属医院骨科，安徽233003）

骨肉瘤（Osteosarcoma）是青少年（10－25岁）最常见的原发于骨髓内的高恶性肿瘤，又称成骨肉瘤，其病程短而进展快，在临床诊断骨肉瘤的病例中，约80%已经发生了血道转移［1］。细胞周期蛋白E（Cyclin E）是细胞周期中G1期和S期重要调节因子，p27蛋白是细胞周期中负性调控因子，两者的表达异常可以引起肿瘤的发生［2－3］。但目前其与骨肉瘤之间的关系尚不清楚，本研究采用免疫组织化学Elivision TM染色法检测108例骨肉瘤中CyclinE和p27蛋白的表达水平，并分析其与患者临床病理因素及预后的关系，探讨其在骨肉瘤发生发展及侵袭转移中的作用和临床意义，为骨肉瘤的预后判断提供新的指标。

材料和方法

1.患者资料

收集蚌埠医学院第一附属医院临床病理科2003年6月到2007年6月存档石蜡包埋经典型骨肉瘤组织108例。所有患者在接受广泛或根治性切除术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗，且具有完整的临床、病理及随访资料，在实施过程中得到患者及人体试验伦理道德委员会（蚌埠医学院）同意。病程1－4个月，平均2.52±0.15个月，其中男性67例，女性41例；年龄6－75岁，平均23.05±3.25岁，其中＜23岁55例，≥23岁53例；低度恶性（G1）26例、高度恶性（G2）82例；有软组织浸润51例、无浸润57例；有远处转移（包括肺转移）49例、无远处转移59例；肿瘤部位：膝关节附近58例（股骨下端34例、胫骨上端24例），颌骨32例（上颌骨22例、下颌骨10例），其他部位18例（肱骨上端9例，腓骨3例，锁骨3例，胸骨3例）；组织分型：成骨细胞型55例，成纤维细胞型27例，成软骨细胞型26例；按Enneking外科分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期40例，Ⅲ期45例。

2.试剂和方法

鼠抗人单克隆抗体Cyclin E（sc－56310）购自美国Santa Cruz公司，浓度为1∶100；即用型鼠抗人单克隆抗体p27购自北京中杉金桥公司，PBS代替一抗作为阴性对照。采用免疫组织化学Elivision TM染色法，每例连续切片数张4μm厚，烤干，置于二甲苯溶液及不同浓度的乙醇中脱蜡至水洗。

免疫组化染色操作步骤按试剂盒说明书进行，CyclinE和p27蛋白主要表达于骨肉瘤和骨软骨瘤细胞的细胞核。其结果按照双侧评分标准检测①每张切片随机观察10个高倍视野，每个视野计数200个细胞；②阳性细胞＜10%为0分，10－50为1分，51－75为2分，＞75为3分；③细胞不着色0分，浅黄色1分，黄色2分，棕褐色3分；④两者分数相乘0～1分为阴性，≥2分为阳性，所有切片均由2位资深病理医师读片评定。

3.随访

所选病例随访至患者死亡或截止2012年10月，随访时间为3－84个月，自首发症状至患者死亡之间的时间定义为总体存活时间（Overall survival time，OS），其中共有7人失访。

4.统计学分析

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。Cyclin E和p27蛋白的表达水平与骨肉瘤患者临床病理因素之间的关系采用卡方检验；CyclinE和p27蛋白阳性与阴性表达组患者5年生存率之间的差异采用 Kaplan－Meier和 Log－rank法比较；CyclinE，p27及临床病理因素与患者预后之间的关系采用Cox多因素分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Cyclin E蛋白表达水平与骨肉瘤患者临床病理因素之间的关系

Cyclin E主要表达于骨肉瘤瘤细胞胞核（图1A），呈棕褐色颗粒样物质。CyclinE蛋白在108例骨肉瘤组织中74例阳性表达，其阳性率为68.52%（74／108）。CyclinE蛋白的表达水平与骨肉瘤的病理分级、软组织浸润、远处转移和Enneking外科分期相关（P＜0.05），与性别、年龄、部位，肿瘤直径和组织学类型无明显相关性（P＞0.05）。CyclinE在骨肉瘤病理分级为G1级者阳性率为11.54%（3／26），G2级为86.59% （71／82）；软组织浸润组阳性率为90.20%（46／51），未浸润组为49.12% （28／57）；远处转移组阳性率为95.92% （47／49），未转移组为45.76%（47／59）；在Enneking外科分期Ⅰ期阳性率为8.70%（2／23），Ⅱ期为75%（30／40），Ⅲ期为93.33%（42／45），组间比较差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.p27蛋白与骨肉瘤患者临床病理因素和CyclinE蛋白之间的关系

p27主要表达于骨肉瘤瘤细胞胞核（图1B），呈棕褐色颗粒样物质。p27蛋白在108例骨肉瘤组织中29例阳性表达，其阳性率为26.85% （29／108）。p27蛋白的表达S水平与骨肉瘤的病理分级、软组织浸润、远处转移和Enneking外科分期相关（P＜0.001），与性别、年龄、部位，肿瘤直径和组织学类型无明显相关性（P＞0.05）。p27在骨肉瘤病理分级G1级者阳性率为76.92%（20／26），G2级为10.98%（9／82）；软组织浸润组阳性率为7.84%（4／51），未浸润组为43.86%（25／57）；远处转移组阳性率为2.04%（1／49），未转移组为47.46%（28／59）；在Enneking外科分期Ⅰ期阳性率为65.22%（15／23），Ⅱ期为32.5%（13／40），Ⅲ期为2.22%（1／45），组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）（见表1）。

Spearman相关性分析显示在骨肉瘤患者中CyclinE和p27蛋白之间呈负相关，R＝－0.579，P＜0.001（见表2）。

3.生存分析

在随访的108例骨肉瘤患者总体生存时间（Overall survival time，OS）大于等于5年者有20.37%（22／108）。Kaplan－Meier和Log Rank分析显示Cyclin E蛋白阳性组骨肉瘤患者OS为28.889±1.404（95%CI 26.136－31.641），5年存活率为4.05%（3／74）；CyclinE蛋白阴性组OS为63.980±2.397（95%CI 59.281－68.678），5年存活率为55.88% （19／34）；p27蛋白阳性组患者OS为64.643±2.630（95%CI 59.487－69.798），5年存活率为65.52% （19／29），阴性组OS为30.560±1.510（95%CI 27.601－33.518），5年存活率为3.80%（3／79）。组间比较差异均有统计学意义（P＜0.001），生存曲线见图2A，2B。

图1 骨肉瘤组织中CyclinE和p27蛋白的表达（Elivision TM×400），1A骨肉瘤组织中CyclinE蛋白表达；1B骨肉瘤组织中p27蛋白低表达。图2 骨肉瘤患者CyclinE和p27蛋白阳性及阴性组表达组总体生存曲线（n＝108）。2A CyclinE蛋白阳性及阴性组患者总体生存曲线；2B p27蛋白阳性及阴性组患者总体生存曲线。Fig.1 The expression of CyclinE and p27 protein in osteosarcoma tissue（Elivision TM×400）.1A.Over－expression of CyclinE protein in osteosarcoma tissue.1B.Low－expression of p27 protein in osteosarcoma tissue.Fig.2 The overall survival curves of patients with osteosarcoma in Cyclin E and p27 protein positive group or negative group（n＝108）.2A OS survival curves of patients with osteosarcoma in CyclinE positive group or negative group；2B OS survival curves of patients with osteosarcoma in p27 protein positive group or negative group.

表1 108骨肉瘤患者中CyclinE和p27蛋白表达水平与临床病理因素的关系Table 1 Expressions of CyclinE and p27 protein and the relationship of them with clinicopathological parameters in 108 osteosarcoma patients

表2 108例骨肉瘤患者中CyclinE和p27蛋白之间关系（n＝108）Table 2 The relationship of CyclinE and p27 protein in 108 osteosarcoma patients（n＝108）

4.多因素预后分析

将性别（男与女）、年龄（＜23岁组与≥23岁组）、肿瘤部位（膝关节附近组、颌骨部位组与其他部位组）、组织类型（骨母细胞型、纤维母细胞型与软骨母细胞型）、肿瘤直径（≥5.0cm组与＜5.0cm组）、软组织浸润（浸润组与无浸润组）、远处转移（转移组与无转移）、病理分级（G1级组与G2级组）、Enneking外科分期（Ⅰ期组Ⅱ期组与Ⅲ期组）、CyclinE和p27（阴性组与阳性组）等因素引入Cox模型进行多因素预后分析，结果显示CyclinE和p27蛋白表达水平、病理分级、软组织浸润、远处转移及Enneking外科分期是影响骨肉瘤患者预后的独立因素（P＜0.05，表3）。

表3 108例骨肉瘤患者COX多因素生存分析Table 3 Multivariate survival analysis of 108 patients with osteosarcoma

讨 论

细胞周期（cell cycle）是细胞物质积累和有丝分裂的循环过程，通过各种细胞周期蛋白（cyclin）和相应的细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin－dependentkinase，CDKs）组成的蛋白激酶复合物调节细胞增殖，包括染色体复制和细胞分裂，而肿瘤是细胞增殖紊乱的疾病［4］，研究表明肿瘤发生中Cyclin E－CDK2在G1／S期的转折中起着重要作用［5］。

Cyclin E基因定位于19号染色体的q12到q13区域，它所编码的蛋白质属于细胞周期蛋白家族，其表达水平的升高始于G1中期，调控细胞从G1期通过限制点“R”（Point of no return）进入S，在细胞分裂G1期末的G1／S期交界处达高峰，进入S期后开始下降，到G2／M期降为零。研究表明，Cyclin E在人类的多种肿瘤中表达显著升高，且与肿瘤的病理分型、侵袭与转移及预后密切相关［6－8］。本研究显示在骨肉瘤组织中Cyclin E蛋白阳性率为68.52%，说明在骨肉瘤组织中存在Cyclin E蛋白的高表达，此时处于分裂增殖状态的细胞CyclinE表达增加，然后激活CDKs，促进细胞进入S期，使其无限增生而导致肿瘤发生，且骨肉瘤组织中Cyclin E表达水平与病理分级、是否发生软组织浸润和远处转移及Enneking临床分期有关，即Cyclin E阳性表达的骨肉瘤具有更高的病理分级、更容易发生软组织浸润和远处转移及更晚的Enneking临床分期，这种现象和Cyclin E在其他肿瘤组织的表现较为一致［9］，提示Cyclin E蛋白高表达可以作为肿瘤预后的标志及治疗的靶点。

p27基因是抑制细胞Gl期的负调控因子，定位于人12号杂色体的12p12.0至12p13.1交界处。p27蛋白与关键的CyclinE－CDK2复合物紧密结合，使其活性受到抑制，从而使细胞周期停滞在G1期不能进入S期，无法进行有丝分裂［10］。本研究结果显示p27蛋白在骨肉瘤组织中的阳性率为26.85%，提示在骨肉瘤组织中p27蛋白低表达，使其对Cyclin E－CDK2复合物的抑制作用降低，从而逃脱了关键点的监视而进入细胞周期进行增生而导致肿瘤发生，并且随着骨肉瘤病理分级的升高、Enneking临床分期的推迟，p27蛋白的表达水平逐渐降低；在软组织浸润和远处转移者，其表达水平也明显低于未浸润及转移者。我们推测可能当p27蛋白表达水平下降时，其阻滞细胞周期作用的减弱或缺失，使细胞出现异常的增殖和分化，促进骨肉瘤的形成及浸润和转移。

多因素分析结果显示CyclinE及p27蛋白的表达水平、软组织浸润、远处转移、病理分级和Enneking分期是影响骨肉瘤预后的独立危险因素（P＜0.05）。进一步生存分析结果显示Cyclin E蛋白阳性组患者5年存活率4.05%显著低于Cyclin E阴性组患者55.88%（P＜0.05）；而p27蛋白表达情况则相反，其阳性表达组患者5年存活率65.52%显著高于阴性组3.80%（P＜0.05），这和Cyclin E和p27蛋白在其他肿瘤中的表达情况及预后表现较为相似［11－13］。

综上所述，在骨肉瘤组织中CyclinE和p27蛋白存在表达差异，可能在CyclinE基因激活的同时伴有p27基因的失活，使得细胞在发育过程中过多的进入细胞周期，导致肿瘤发生乃至浸润转移，使得患者有较差的预后，CyclinE和p27蛋白是骨肉瘤发生发展乃至浸润转移中较为关键事件，可以作为骨肉瘤预后判断的新指标。

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