银杏内酯滴丸质量控制方法探讨

吴洪君

（江苏鹏鹞药业有限公司，江苏 宜兴214200）

银杏为银杏科银杏属植物，它的果、叶均可作药用，具有益心敛肺、化湿止泻等作用。银杏叶中的银杏内酯具有高度专属性拮抗血小板活化因子（PLatelet Activating Factor，PAF）的作用，其中内酯类化合物有：银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯M、银杏内酯J及白果内酯，研究表明，人与动物的许多细胞在细胞内毒素、免疫球蛋白（IgE）、白介素－1（IL－1）和肿瘤坏死因子（TNF）等的刺激下能合成与释放PAF，而从天然产物中筛选出的银杏内酯，已成为迄今评价最多的拮抗剂，其在心、脑血管系统、中枢神经系统、血液系统、肝炎、肺炎治疗方面显示较好的应用前景［1－2］。目 前已 经 有 文 献 报 道 用HPLC－ELSD 法 测 定 注 射用银杏内酯中银杏内酯A 和B的含量、测定银杏内酯注射液中银杏内酯A 和B的含量［3－5］，但是银杏内酯滴丸的银杏内酯A 和B的含量的测定鲜见报道。本文对银杏内酯滴丸的含量测定方法进行了研究，同时对滴丸中主成分的提取条件进行了筛选，进一步确认了HPLC－ELSD 法测定银杏内酯滴丸中的银杏内酯A 和B的含量是准确、灵敏、快速、可行的。

1 资料与仪器

仪器：Shimadzu LC－10AT 系列HPLC，Alltech ELSD 800蒸发光散射检测器。

色谱柱：HypersiLC18（5μ，4.6mm×25cm）；Sartorius BT－25S型电子分析天平。

正丙醇和四氢呋喃：色谱纯（默克）；纯水：自制纯化水。

银杏内酯A：中国药品生物制品检定所，批号：0862－200004。

银杏内酯B：中国药品生物制品检定所，批号：110863－200204。

银杏内酯滴丸样品：江苏鹏鹞药业有限公司自制，批号：100107－1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

仪 器：Shimadzu LC－10AT 系列HPLC，Alltech ELSD 800蒸发光散射检测器。

流动相：正丙醇－四氢呋喃－水（1∶25∶74）。

流 速：1.0mL／min；柱温：35℃；漂移管温度：110℃；氮气流速2.5mL／min。

2.2 溶液制备和测定方法

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取银杏内酯A 对照品、银杏内酯B 对照品适量，加甲醇制成每mL各含0.5mg、1.0mg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品20丸，精密称定，研细，取细粉适量（约含银杏内酯12mg），精密称定，置10mL 量瓶中，加甲醇适量，超声处理30min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.2.3 测定法

分别精密吸取对照品溶液5μL、10μL，供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B的含量，即得。

2.3 提取条件的筛选

2.3.1 提取方法的选择

取研细的本品，精密称定2 份，每份约含银杏内酯12mg，一份置10mL 量瓶中，加甲醇适量，超声处理30min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得；另一份加水10mL，置水浴中温热使溶散，加2%盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次，合并提取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密量取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，结果见表1。

表1 提取方法筛选结果

结果表明：样品直接用甲醇溶解过滤和用乙酸乙酯提取效率基本一致，甲醇溶解过滤虽然空白辅料峰较乙酸乙酯提取大，但不影响含量测定，且操作简单，误差较小。

2.3.2 溶剂筛选

取研细的本品适量，精密称定3份，每份约含银杏内酯12mg，分置3个10mL 量瓶中，分别加入30%、50%、100%甲醇溶液适量，超声处理30min，取出，放冷，用相应的溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得。精密量取10μL，注入液相色谱仪，测定，结果见表2。

表2 溶剂筛选结果

结果表明：30%、50%的甲醇溶液提取效率较低，100%甲醇的最高，故选用甲醇作为提取溶剂。

2.3.3 超声时间筛选

取研细的本品，精密称定4 份，每份约含银杏内酯12mg，分置4个10mL 量瓶中，分别加入甲醇适量，分别超声处理10min、20min、30min和40min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得。精密量取10μL，注入液相色谱仪，测定，结果见表3。

表3 超声时间筛选结果

结果表明：超声处理20min和30min提取效率基本相当，为确保提取完全，故选择超声提取30min。

2.4 方法学考察

2.4.1 检测限

取对照品溶液，经逐步稀释后，进样，银杏内酯A 的检测限约为0.05μg，银杏内酯B的检测限约为0.08μg。

2.4.2 专属性

按处方比例配制不含银杏内酯的空白滴丸剂，按含量测定方法制成空白溶液，精密量取10μL，注入液相色谱仪，由色谱图可知，空白辅料不干扰银杏内酯的检出。

2.4.3 标准曲线

对照品溶液的制备：分别精密称取银杏内酯A 对照品、银杏内酯B对照品适量，加甲醇制成每mL 各含0.490mg、1.018mg的混合溶液，作为对照品溶液。分别精密量取溶液5、10、15、20、25μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，分别以浓度的对数为横坐标，峰面积的对数为纵坐标，计算线性方程和相关系数，绘制标准曲线，结果见表4和表5。

表4 银杏内酯A线性范围试验结果

表5 银杏内酯B线性范围试验结果

结果表明：银杏内酯A 进样量在2.45～12.25μg·mL－1浓度范围内，银杏内酯B进样量在5.09 ～25.45μg·mL－1浓度范围内，线性关系良好。

2.4.4 溶液稳定性

取本品按“2.2.2”制成供试品溶液，每隔2h进样，结果表明：8h内，银杏内酯A、B的峰面积值基本稳定，故可知本品供试品溶液8h内稳定。

2.4.5 回收率

取本品磨成细粉，精密称定11份，每份约含银杏内酯6mg，分别置5mL量瓶中，精密量取上述对照品溶液1mL、2mL、3mL各3份于上述称定的9份样品中，各量瓶中分别加甲醇适量，超声处理30min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品溶液5μL、10μL，供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B的含量，计算回收率。结果表明：银杏内酯A 的加样回收率为99.06%，测得的RSD 为1.0%；银杏内酯B 的加样回收率为98.99%，测得的RSD为0.9%。

2.5 样品中银杏内酯含量测定

照“2.2.3”项下测定方法测定本品三批银杏内酯含量，平均含量分别为23.32mg／丸、22.76mg／丸和25.61mg／丸，均大于18mg／丸，符合规定。

3 结论

银杏内酯的主要成分无C＝C双键和共轭结构，无法采用紫外检测器检测，示差检测器对温度等外界因素响应过于灵敏，用于检测该品种重现性和检测灵敏度差。ELSD 属于质量型检测器，近年来应用日趋广泛［3－5］，且不存在试剂干扰问题，故本研究选用ELSD 检测器检测。本研究又通过提取方式、溶剂和提取时间的选择，确定了提取工艺条件。本研究还进行了一系列的专属性、线性、回收率、溶液稳定性试验，试验数据证明：采用文中的色谱条件和优选出的样品提取工艺条件来检测银杏内酯滴丸中的银杏内酯A 和B的含量准确、灵敏、快速、可行。

［1］ 王兴鹏，袁耀宗，徐家裕.银杏苦内酯对急性胰腺炎大鼠的治疗作用及机制［J］.中国药理学通报，1995，11（03）：199－201.

［2］ 李钦，马凤仙，程铁峰.HPLC－ELSD法测定银杏酮酯滴丸中中萜类内酯的含量［J］.中成药，2007，29（6）：836－838.

［3］ 李林燕，许益清.高效液相色谱法测定银杏内酯B 注射液含量［J］.医药导报，2009，28（8）：223－225.

［4］ 李宁，张国庆，赵玉兰，等.HPLC－ELSD 法测定银杏内酯B注射剂的含量及有关物质［J］.现代科学仪器，2007，24（3）：67－69.

［5］ 戴翔翎，凌娅，施玮，等.HPLC－ELSD 法测定注射用银杏内酯中银杏内酯A 与银杏内酯B 的含量［J］.南京中医药大学学报，2005，21（1）：22－23.