三种色谱法分析鲍鱼生殖腺多糖的单糖组成

宋叶涵李冬梅，2杨静峰，2朱蓓薇，2

（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.国家贝类加工技术研究分中心（大连），辽宁 大连 116034）

三种色谱法分析鲍鱼生殖腺多糖的单糖组成

宋叶涵1李冬梅1，2杨静峰1，2朱蓓薇1，2

（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.国家贝类加工技术研究分中心（大连），辽宁 大连 116034）

为了选择一种准确有效的方法测定鲍鱼生殖腺多糖（AGP－32）的单糖组成。采用薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法对AGP－32的单糖组成进行测定。结果表明：高效液相色谱法较其它色谱方法具有分离效果好，并可同时检测中性糖、糖醛酸和氨基糖等特点，并利用该法得到单糖组成的摩尔比为 Man∶Rha∶GlcA∶GalA∶Glc∶Gal∶Xyl∶Fuc＝0.79∶2.05∶1.6∶0.58∶0.09∶4.91∶0.11∶0.34。说明高效液相色谱法较其它色谱法更加适合于鲍鱼生殖腺多糖这类复杂样品的单糖组成分析。

鲍鱼；生殖腺多糖；硫酸酯多糖；单糖组成；薄层色谱法；气相色谱法；高效液相色谱法

鲍鱼属软体动物门、腹足纲，是名贵的海珍品，具有丰富的营养价值和药用价值［1］。鲍鱼生殖腺多糖是从鲍鱼生殖腺中分离得到的硫酸酯多糖。近年来的研究［2－7］表明，鲍鱼生殖腺多糖具有一定的抗氧化、增强免疫和抗肿瘤及抗凝血等活性。鲍鱼生殖腺多糖结构复杂、生物活性多样，疗效明显，因此有必要对其结构进行深入的研究。单糖组成分析作为研究多糖结构的基础，因而成为一项亟待解决的问题。

本试验通过薄层色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法3种衍生化方法，对鲍鱼生殖腺多糖的单糖组成进行定性和定量分析，并对不同的衍生化方法的特点和测定结果进行比较分析，为今后准确和有效地选用这些方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲍鱼生殖腺：大连獐子岛渔业有限公司；

D－甘露糖、D－半乳糖、D－葡萄糖、鼠李糖、木糖、岩藻糖、L－阿拉伯糖、D－葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、D－氨基葡萄糖盐酸盐共10种单糖标准品：美国Sigma公司；

三氟乙酸、三氯甲烷和甲醇：均为色谱纯；

1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）、吡啶、盐酸羟胺、乙酸酐、六甲基二硅胺烷、硼氢化钠、醋酸、碳酸钠、正丙胺、三甲基氯硅烷：均为分析纯试剂。

1.2 主要仪器

气相色谱仪：6890N，美国Agilent公司；

石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm）：HP－5，美国Agilent公司；

高效液相色谱仪：LC－10Avp，日本岛津公司；

Tigerkin C18柱（4.6mm×250mm，5μm）：Tigerkin系列液相色谱柱，大连思普精工有限公司；

氮气吹干仪：DN－12A，天津市乐康科技有限公司。

1.3 鲍鱼生殖腺多糖的分离纯化

依据本课题组［1］前期建立的蛋白酶水解提取法提取鲍鱼生殖腺粗多糖（abalone gonad polysaccharide，AGP）。将提取的鲍鱼生殖腺多糖以Sevag法去除蛋白，采用Cellulose DEAE－52柱和Sepharose CL－6B柱，收集得到纯度良好的鲍鱼生殖腺多糖（AGP－32）。

1.4 薄层色谱法

准确称取20mg AGP－32溶于2mL 2mol/L的硫酸中，在100℃下，水解6h，用BaCO3中和至中性，4 000r/min离心10min、取上清液。分别称取10mg的葡萄糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖及混合标准单糖，并分别加入2mL蒸馏水溶解。点样量为2μL，在贮有展开剂正丁醇∶水∶乙醇（3∶2∶5）的展开箱中，上行展开，展距10cm。从展箱中取出薄板，吹干，放入显色剂乙醇∶浓硫酸 （9∶1）水溶液中，取出吹干，100℃加热显色约8min［8］。

1.5 气相色谱法

1.5.1 糖腈乙酸酯衍生化法

（1）多糖的水解：准确称取10mg AGP－32溶于2mL 2mol/L的三氟乙酸中，充N2密封，在100℃下水解4h，反复加甲醇并用N2吹干，作为AGP－32水解产物备用。

（2）单 糖的衍生化［9］：向 AGP－32水解产物中，加入8mg盐酸羟胺、0.5mL吡啶、1mg肌醇，漩涡振荡后，于90℃水浴中加热30min，取出后冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，在90℃恒温水浴乙酰化30min，反应产物经0.45μm滤膜过滤后注入气相色谱进行分析；标准单糖作同法处理，并制成标准单糖衍生物混合液。

（3）色谱条件：HP－5石英毛细管色谱柱；载气为N2；采用氢火焰离子检测器（FID），进样口气化温度250℃，检测温度250℃，柱温采用程序升温：从0min到5.00min为130℃，然后以4.00℃/min的速度由130℃升至240℃保留10.00min。

1.5.2 三甲基硅醚衍生化法

（1）多糖的水解［1］：准确称取10mg AGP－32，加入2mL无水HCl－甲醇，充N2封管，80℃甲醇解20h。反应完成后，冷却至室温，以无水KOH－甲醇中和至pH 6.0，减压蒸干，常规干燥，作为AGP－32甲醇解产物备用。

（2）单糖的衍生化［1］：向 AGP－32甲醇解产物中加入0.2mL无水吡啶（内含饱和甘露醇，作内标），振荡摇匀，于恒温干燥箱75℃溶解30min，再振荡均匀，加入0.3mL硅烷化试剂六甲基二硅胺烷∶三甲基氯硅烷（2∶1），振荡，静置30min，3 000r/min离心10min，取上清液进行气相色谱分析；标准单糖作同法处理，并制成标准单糖衍生物混合液。

（3）色谱条件：HP－5石英毛细管色谱柱；载气为N2；氢火焰离子检测器（FID），进样口气化温度250℃，检测温度250℃，柱温采用程序升温：从0min到1min为150℃，然后以10℃/min的速度升至182℃，保持2min，再以1℃/min的速度升至188℃，保持1min，最后以8℃/min的速度升至230℃。

1.6 PMP柱前衍生化高效液相色谱法

1.6.1 多糖的水解 参照文献［10］。称取2mg AGP－32溶于1mL 2mol/L的三氟乙酸，充N2密封，于121℃水解2h，取出后加无水甲醇，N2吹干，作为AGP－32水解物备用。

1.6.2 衍生化标记 参照文献［10］。分别称取甘露糖、葡萄糖、D－氨基葡萄糖及半乳糖各0.001 8g，鼠李糖及岩藻糖各0.001 6g，木糖及阿拉伯糖各0.001 5g，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸各0.001 9g，混合，作为混合标准单糖备用。将AGP－32水解物、10种标准单糖（各10mg）和混合标准单糖，溶于5mL氨水中，取该溶液100μL与100μL的PMP/甲醇溶液（0.5mol/L）混合，在70℃下反应30min。取出后冷却至室温，加入1.5mL纯水，真空干燥，重复2次。干燥后的物质用1mL纯水及1mL氯仿溶解，充分振荡后除去有机相，重复3次，静置30min，取上清液进行HPLC分析。

1.6.3 色谱条件 色谱柱 Tigerkin C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流 动 相 0.1mol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液（Na2HPO4－NaH2PO4，pH 6.7）－乙腈（83∶17），流速1mL/min；检测波长254nm；柱温30℃；标准品进样体积10μL，样品进样体积20μL。

2 结果与讨论

2.1 薄层色谱法测定结果

采用TLC法测定AGP－32单糖组成的结果见图1。根据各单糖标准品的Rf值和所显颜色，可以初步确定AGP－32主要由鼠李糖和半乳糖组成，但由于个别单糖的显色斑点有重叠，因此难以分辨AGP－32中可能含有的其它单糖。

图1 AGP－32多糖水解物薄层色谱图Figure 1 TLC chromatogram of AGP－32hydrolysates

2.2 气相色谱法测定结果

2.2.1 糖腈乙酸酯衍生化法测定结果 标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物气相色谱图见图2。由图2可知，该法得到的单糖出峰时间短，峰形对称，未出现拖尾现象，并且得到较好的基线分离效果。AGP－32多糖水解成单糖后的糖腈乙酸酯衍生物气相色谱图见图3。根据图2和图3的出峰时间进行对照，再经归一化法求得各单糖组成的摩尔比为鼠李糖∶岩藻糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖 ＝1.34∶0.54∶0.26∶1.10∶0.11∶5.91。

图2 标准单糖糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图Figure 2 GC chromatogram of aldoononitrile acetate derivatives of monosaccharide standards

图3 AGP－32水解后糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图Figure 3 GC chromatogram of aldoononitrile acetate derivatives after acidic hydrolysis

2.2.2 三甲基硅醚衍生化法测定结果 标准单糖的三甲基硅醚衍生物气相色谱图见图4。三甲基硅醚化衍生物具有挥发性好，制备简单、反应迅速的优点［11］，但由图4可知，该法产生了较多的异构峰，给多糖的定性和定量带来了一定的困难。AGP－32多糖水解成单糖后的三甲基硅醚衍生化物气相色谱图见图5。对照图4和图5的单糖出峰时间，经归一化法计算得各单糖的组成摩尔比为鼠李糖∶岩藻糖∶甘露糖∶半乳糖 ＝0.71∶1.73∶0.3∶17.97。此结果与2.2.1比较可知，三甲基硅醚衍生化法未能得到完整的单糖组成信息。

2.2.3 高效液相色谱法测定结果 标准单糖的PMP衍生物的高效液相色谱图见图6，采用柱前衍生化高效液相色谱法进行分析时，各单糖间具有理想的分离度，并且PMP峰未掩盖单糖峰。AGP－32多糖水解成单糖后的PMP衍生物的高效液相色谱图见图7。

根据各单糖标准品的出峰时间，可确定AGP－32是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖组成的杂多糖。根据标准单糖的峰面积之比，采用归一化法求得AGP－32中单糖组成的摩尔比为甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶岩藻糖＝0.79∶2.05∶1.6∶0.58∶0.09∶4.91∶0.11∶0.34。从峰面积百分比可以看出，鼠李糖和半乳糖在该多糖中所占比例较大，是鲍鱼生殖腺多糖的主要成分，这与气相色谱法分析单糖组成得到的结果基本一致。

图4 标准单糖三甲基硅醚衍生物的气相色谱图Figure 4 Gas chromatograms of TMS derivatives of monosaccharide standards

图5 组分AGP－32三甲基硅醚衍生物的气相色谱图Figure 5 Gas chromatograms of TMS derivatives of monosaccharide of AGP－32

图6 混合标准单糖的PMP衍生物的色谱分离图Figure 6 Chromatograms of PMP derivatives of monosaccharide standard samples

图7 AGP－32水解后的PMP衍生物的色谱分离图Figure 7 Chromatograms of PMP derivative of hydrolysate of fraction AGP－32

3 讨论

采用薄层层析法与各单糖标准品的Rf值和所显颜色进行比较，可以初步确定AGP－32主要含有鼠李糖和半乳糖，但由于部分单糖的显色斑点有重叠，因此难以分辨是否含有其他单糖。采用TLC测定单糖组成具有操作简便、快捷等优点，但分辨率不高，一般只作定性或半定量分析。

气相色谱分析主要是利用试样中各组分在色谱柱气相和液相间的分配系数不同而进行的。同种单糖经不同的衍生化处理后得到不同的衍生产物，出现极性差异，保留时间发生较大变化［12］。

三甲基硅醚衍生化法具有制备简单，反应迅速，衍生物挥发性好等特点，但是该法易产生多种衍生物的异构体，给定性和定量带来一定的困难。本试验结果表明，采用三甲基硅醚衍生化法并未得到完整的AGP－32单糖组成信息，其中未检测到葡萄糖，而半乳糖含量相对较高。这很可能是由于D－葡萄糖和D－半乳糖是异构体，而这二种构型相近的己糖可能形成相同的二肟，因此这二个糖的二肟三甲基硅醚衍生物得到一个峰［13］。

糖腈乙酸酯衍生化法反应时间短，各峰分离效果好，异构峰相对较少，单糖组成定性及定量准确，其中单糖组分中含量较高的是鼠李糖、半乳糖和甘露糖，这与薄层色谱法和三甲基硅醚衍生化法测定结果一致。但此法仅适合于醛糖的分析，酮糖因缺乏还原端而难以衍生，糖醛酸与氨基糖也不适用于此法［14］。对酮糖的分析可选用三甲基硅醚衍生化方法。

高效液相色谱法通过导入具有紫外或荧光的化学基团对糖类进行柱前衍生，其优点是可以在温和的条件下与还原糖链进行定量反应，生成在紫外245nm处有强烈吸收的衍生物，而且产物无立体异构现象［14］。本试验采用PMPHPLC法测定AGP－32多糖的单糖组成，不仅可以检测出鼠李糖、甘露糖和半乳糖等中性糖，而且还可同时检测葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，并可进行定量分析。该法得到的单糖组成结构信息完整，定性准确，其中鼠李糖与半乳糖比例相对较高，此现象与以上几种方法所得结论相符，因此高效液相色谱法较薄层色谱法和气相色谱法更适合于单糖组成较为复杂的样品分析。

4 结论

薄层色谱法操作快捷有效、无需衍生化处理，但单糖间的分离效果较差，比较适合对单糖组成较为简单的样品进行定性分析。气相色谱法和高效液相色谱法检测灵敏度高、分离效果好、定量准确，但气相色谱法不适合糖醛酸和氨基糖的分析。高效液相色谱法可同时检测AGP－32中中性糖、糖醛酸和氨基糖，较其它单糖组成测定方法更加适合于像鲍鱼生殖腺多糖这种复杂样品的单糖组成分析。

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Comparison of three chromatographic methods for monosaccharide composition analysis of abalone gonad polysaccharide

SONG Ye－han1LI Dong－Mei1，2YANG Jing－feng1，2ZHU Bei－wei1，2

（1.School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian，Liaoning116034，China；2.National R＆D Branch Center for Shellfish Processing（Dalian），Dalian，Liaoning116034，China）

To find an accurate and effective method to determine the monosaccharide composition of polysaccharide from abalone gonad（AGP－32）.Thin layer chromatography，gas chromatography and high performance liquid chromatography were used to determine the monosaccharide composition of AGP－32.Results：Method of high performance liquid chromatography had good resolution，and it was suitable to simultaneous analyses of neutral，acidic and alkaline monosaccharide.The monosaccharide composition of AGP－32which identified by this method was Man∶Rha：GlcA∶GalA∶Glc∶Gal：Xyl∶Fuc＝ 0.79：2.05∶1.6：0.58∶0.09：4.91∶0.11∶0.34.Conclusion：High performance liquid chromatography is more suitable than other chromatographic methods to complicated monosaccharide composition analysis of polysaccharide such as abalone gonad polysaccharide.

abalone；gonad polysaccharide；sulfated polysaccharide；monosaccharide composition；thin layer chromatography；gas chromatography；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.011

国家自然科学基金项目（编号：31171635）

宋叶涵（1987－），女，大连工业大学在读硕士研究生。E－mail：songyehan＿2007＠126.com

杨静峰

2012－01－01