鸡胚蛋中水溶性维生素的测定及其孵化期间的变化

范 亮张 彧陈历俊姜铁民

（1.大连工业大学，辽宁 大连 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085）

鸡胚蛋中水溶性维生素的测定及其孵化期间的变化

范 亮1，2张 彧1陈历俊1姜铁民2

（1.大连工业大学，辽宁 大连 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085）

对鸡胚蛋中水溶性维生素的色谱测定方法进行优化和验证，5种维生素的加标回收率均在90%以上，且在0.1～50μg/mL具有良好的线性相关性；采用RP－HPLC对不同胚龄（即入孵的第0、2、4、6、8、10、12、14、16和18天）肉鸡胚胎发育过程中的5种水溶性维生素（核黄素、烟酸、烟酰胺、吡哆醇和叶酸）进行测定与分析，并与鲜蛋进行对比。结果表明，随着孵化时间的延长，维生素B2、烟酸和叶酸3种维生素均有不同程度的增加，其中烟酸增加3.2倍，维生素B2增加31%；叶酸在12d达到最高，比鲜蛋约增加1倍；未能检测出维生素B6和烟酰胺。

鸡胚蛋；水溶性维生素；核黄素；烟酸；叶酸

鸡胚蛋是受精鸡蛋孵化至一定天数后，还未破壳，可食用的鸡蛋，据《本草纲目》记载：“鸡胚蛋有治疗头痛、偏头痛、头风病及四肢疯障之功能。”民间早有食用的习惯，俗称“喜蛋”、“毛蛋”、“活珠子”等。而一个受精鸡蛋能否正常发育，除了要求有正常的孵化条件外，在一定程度上还取决于孵化期间内营养成分的变化情况，因此弄清各种营养的代谢变化规律，对调控禽类胚胎发育，提高孵化率有着重要的意义。

已有学者对鸡胚蛋孵化期间的营养变化情况进行了研究：李利东等［1］研究发现鸡胚蛋孵化期间多种对人体有益的营养元素均有所增加，如牛磺酸增加了将近20倍，VE增加了100倍，钙含量增加6倍多等，而对人体不利的脂肪含量下降50%，胆固醇下降5.5倍等，其研究结果与李国喜等的研究［2，3］基本一致；刘娟娟［4］比较了不同品种鸡胚蛋孵化期间营养物质的变化规律情况，发现不同品种的鸡胚蛋在孵化期间变化规律也略有不同，但总体趋势相似；房兴堂等［5］还对鸡胚蛋的蛋白质脂肪的转化转移进行了一定的研究，发现胚胎中的蛋白质和脂肪主要来源于蛋黄。但目前还没有对鸡胚蛋中的一些重要的水溶性维生素进行研究的报道，如参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程和糖类无氧过程的烟酸和烟酰胺；参与神经递质、糖原、核酸以及所有氨基酸代谢的维生素B6以及对神经细胞与脑发育有促进作用的叶酸等。因此，本试验分别对不同胚龄鸡胚蛋中的维生素B2，烟酸、烟酰胺、维生素B6以及叶酸进行检测分析，旨在为人们食用鸡胚蛋提供科学依据，同时也对鸡胚蛋的深加工提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 样品

样品取自北京华都食品有限公司，分别取无精蛋、鲜蛋、0，2，4，6，8，10，12，14，16，18d胚龄鸡蛋，去壳后用高速匀浆机混匀，并分装于－20℃保存待测

1.2 主要试剂

盐酸吡哆醇、叶酸、烟酸、烟酰胺和核黄素标准品：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

三氟乙酸：色谱纯，美国Tedia公司；

乙腈：色谱纯，美国Fisher公司；

水：市售娃哈哈纯净水；

其余试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器

高效液相色谱仪：含LC－10ATVP二元泵，SPD10Avp紫外检测器，classvp软件，日本Shimadzu公司；

双光束紫外可见光分光光度计：Cintra20，澳大利亚GBC公司；

冷冻离心机：2K15，美国Sigma公司；

C18色谱柱：Venusil XBP C18，天津博纳杰艾尔科技有限公司。

1.4 标准溶液配制

1.4.1 烟酸、烟酰胺、吡哆醇 分别取烟酸、烟酰胺和吡哆醇溶液50mg于50mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度［6］。

1.4.2 叶酸 称取10mg叶酸，溶解于0.01mol/L氢氧化钠乙醇溶液（乙醇∶水＝1∶4）并定容至100mL［7］。

1.4.3 核黄素 取50mg核黄素溶于0.02mol/L乙酸溶液中，并定容至500mL棕色容量瓶中［8］。

1.5 样品提取

1.5.1 核黄素、烟酸、烟酰胺和吡哆醇 参照文献［9］提取烟酸、烟酰胺和维生素B6，并稍加改动，称取样品1～2g于150mL三角瓶中，加入0.1M盐酸溶液，于121℃水解30min，冷却后，以2.5M乙酸钠调pH至4.5，转入50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，用0.22μm过滤后待测。

1.5.2 叶酸 参照文献［10］并稍加改动，称取1～2g样品于150mL三角瓶中，加入0.026mol/L Tric－HCl缓冲溶液（pH 7.4）含有1% （m/V）抗坏血酸钠20mL，121℃高压水解20min，转移至50mL容量瓶中，加入5%三氯乙酸5mL，用超纯水定容至刻度，混匀于4℃6 000r/min离心20min，上清液经过0.22μm滤膜过滤贮存于4℃待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

采用等度洗脱，流动相为三氟乙酸（TFA）水溶液（含1g/L庚烷磺酸钠）和乙腈，选用反相C18色谱柱5μm（4.6mm×25cm），本试验研究了不同浓度（3%～40%）乙腈对样品出峰时间的影响，发现高浓度乙腈能缩短出峰时间，但是会导致烟酸和烟酰胺无法分离，较低浓度乙腈会延长保留时间。由图1可知，当乙腈浓度为10%时，可较好的分离核黄素、烟酸、烟酰胺和吡哆醇。由图2可知，当乙腈浓度为15%时，叶酸在25min内可出峰，且样品分离效果良好，故将检测叶酸的最适乙腈浓度定为15%。此外，流动相的pH 对分离水溶性维生素也至关重要［11］，Ciul.M 等［12］采用0.025%TFA水溶液和乙腈梯度洗脱检测蜂蜜中的水溶性维生素，得到了较好的结果。本试验研究了不同浓度的TFA（0.025%～0.1%）对维生素分离的影响，结果表明在较低浓度TFA下叶酸和维生素B2均有拖尾现象，在浓度升至0.1%时，能较好的解决拖尾问题，且分离效果良好。

图1 标准混合液及鸡胚蛋提取液色谱图Figure 1 Chromatograms of a standard mixture of nicotinamide，nicotinic acid，riboflavin，pyridoxin and embryoed eggs

在190～500nm下对5种维生素进行波长扫描，其最大吸收波长分别为核黄素260nm、盐酸吡哆醇290nm、烟酸和烟酰胺260nm、叶酸255nm，为方便试验，将盐酸吡哆醇的吸光值设为290nm，其余均为260nm，该结果也与田颖等的研究［13］一致，柱温采用 25 ℃［12，14，15］。

由图1还可知，4种水溶性维生素的保留时间分别为烟酰胺tR＝15.3min、烟酸tR＝18.2min、核黄素tR＝38.1min和吡哆醇tR＝38.4min，但是在样品中没有发现烟酰胺和吡哆醇，在食物营养成分表中也未查到鸡蛋中烟酰胺和吡哆醇含量，这也与本试验的研究结果一致。由图2还可知，叶酸的保留时间为tR＝21.4min。

2.2 方法验证

2.2.1 检出限 进空白样品，以基线3倍噪声值在标准曲线差得结果计算，测得5种维生素的检出限分别为核黄素0.12μg/mL、烟酸0.075μg/mL、烟酰胺0.06μg/mL、吡哆醇0.045μg/mL、叶酸0.09μg/mL（表1），而 Lebiedzinska等［14］所得各种维生素的检测限在0.19～9.2ng/mL，与本试验结果有较大出入，可能是仪器的不同而造成的。

2.2.2 线性范围 将逐级稀释的维生素混合标准工作液分别进样10μL，测得结果以峰面积为Y对质量浓度x（μg/mL）作图，结果见表1。由表1可知，各种维生素在0.1～50μg/mL线性关系良好。

图2 叶酸标准品溶液和鸡胚蛋提取液色谱图Figure 2 Chromatograms of a standard solution and embryoed eggs

表1 方法验证Table 1 Validation data

2.2.3 精密度和回收率 在上述试验条件下，取混合标准样品溶液5.0μg/mL，进样量10μL，平行测定5次，计算其变异系数，同时取已知浓度的样品，分别加入样品浓度的50%，100%，150%的混合标准溶液，按1.5的方法制备后进行测定，结果（见表1）5种维生素的变异系数在3.34～6.18（n＝5），回收率均在90%以上，Ciulu等［12］研究表明各种维生素的回收率在90%～110%，变异系数在2.6～7.6，也与本试验结果基本一致。

2.3 不同胚龄鸡胚蛋中水溶性维生素的含量

通过与水溶性维生素标准混合液的保留时间的对比并向样品提取溶液中加入已知浓度标准溶液来确定样品中含有相应的维生素。之后对混标进行分析，待各个样品完全分离后再分别对单个样品进行分析以确定各个物质的出峰时间，外标法定量。在线性范围内选取5个不同的浓度制作各个维生素的标准曲线，结果见表2。

表2 不同孵化期间鸡胚蛋水溶性维生素含量变化+Table 2 Average concentration of water－soluble vitamins of different period embroyed eggs origin /（mg·kg－1）

由表2可知，鸡胚蛋中维生素含量有所差别，其中以烟酸最多、叶酸次之、维生素B2最少，烟酰胺和维生素B6含量低于检测限。

如果鸡胚蛋中缺乏核黄素，在孵化至10～14d时会发生鸡胚死亡。在孵化过程中所检测的维生素B2的含量增加了31.2%，这与刘娟娟的研究结果［4］略有出入，她所检测的4个品种的鸡胚蛋在孵化过程中维生素B2含量均略有降低，但是变化不显著，这可能与维生素B2主要以黄素蛋白的辅酶形式参与生理生化代谢有关［16］，自身含量损失不大。

烟酸含量增加3.7倍，且在0～12d烟酸含量增加缓慢，在12d后迅速增加，一方面这与鸡胚蛋在孵化12d后胎儿开始大量吞食蛋白羊水导致水分急剧下降有关［1，4］，因未发现烟酰胺，故烟酸的增加含量并非是烟酰胺转化而来，而在动物体内，色氨酸可以转化为烟酸，且转化率与肝脏中的色氨酸加氧酶有很大关系。研究［17］表明，鸡胚在12d时肝脏生长速度开始加快，有可能在肝脏增重的过程中增加了色氨酸加氧酶的分泌从而促进了色氨酸－烟酸的转化。

在孵化过程中，叶酸的含量呈现“先增加后减小”的趋势，且在第12天含量达到最大，比鲜蛋约增加一倍，因为叶酸无法在体内合成和转化，所以可能的原因是在整个孵化过程中胚蛋内水分含量大大降低，从而导致干物质含量上升［1，4］，而随着孵化的进行，至10～11d时，胚胎的心脏、肝脏和大脑等器官生长速度开始加快，并于16d时达到生长高峰期［17］，在此过程中鸡胚DNA的合成，神经系统的发育以及氨基酸的代谢均发生了很大变化，而这些生理反应变化均依赖叶酸的参与进行，因此在12d后，叶酸的含量一直处于逐渐降低。从另一方面讲，如果从补充叶酸含量来考虑，应该选取12d之前的鸡胚蛋。

3 结论

各种维生素在0.1～50μg/mL均有良好的线性关系，检测限分别为核黄素0.12μg/mL，烟酸0.075μg/mL，烟酰胺0.06μg/mL，吡哆醇0.045μg/mL，叶酸0.09μg/mL，变异系数在3.34～6.18且回收率均在90%以上。该方法同样也可用来分析蛋制品的水溶性维生素含量。检测了不同孵化期间鸡胚蛋中水溶性维生素的含量变化情况，在孵化过程中核黄素、烟酸和叶酸的含量均有不同程度的增加，其中烟酸含量增加最多，约增加3.2倍，核黄素增加不明显，而叶酸在12d时达到最大，并在12d后逐渐降低，整个孵化过程中均未发现烟酰胺和吡哆醇。

1 李利东，袁建兴，宓晓黎，等.不同孵化期的鸡胚蛋营养和功效成分研究［J］.食品科学，2004，25（11）：287～290

2 李国喜，康相涛，韩瑞丽，等.固始鸡孵化期间蛋黄胆固醇和粗脂肪和锌含量分析［J］.湖北农业科学，2006，45（4）：497～499

3 李国喜，康相涛，田亚东，等.固始鸡孵化期间蛋壳内钙鳞含量变化规律研究［J］.中国农学通报，2006，22（4）：4～7

4 刘娟娟.不同品种鸡胚蛋孵化期间营养物质的变化［D］.泰安：山东农业大学，2007.

5 房兴堂，丁梅，赵春梅.乌骨鸡胚胎发育过程中卵内蛋白质脂肪的变化研究［J］.生命科学研究，2004，8（2）：185～188

6 中华人民共和国国家标准.GB 5413.15——2010婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

7 中华人民共和国国家标准.GB/T 5009.211——2008食品中叶酸的测定［S］.北京：中国标准出版社，2009.

8 中华人民共和国国家标准.GB/T 9695.28——2008肉与肉制品维生素B2的测定［S］.北京：中国标准出版社，2009.

9 S Ndaw，M Bergaentzle，D Aoude－Werner，et al.Extraction procedures for the liquid chromatographic determination of thiamin，riboflavin and vitamin B6in foodstuffs［J］.Food Chemistry，2000，71（1）：129～138

10 R Póo－Prieto，D B Haytowitz，J M Holden，et al.Use of the affinity/HPLC method for quantitative estimation of folic acid in enriched cereal－grain products［J］.The Journal of Nutrition，2006，136（12）：3 079.

11 B A J van Landeghem，J Puts，H A Claessens.The analysis of thiamin and its derivatives in whole blood samples under high pH conditions of the mobile phase［J］.Journal of Chromatography B，2005，822（1～2）：316～321.

12 M Ciulu，S Solinas，I Floris，et al.RP－HPLC determination of water－soluble vitamins in honey［J］.Talanta，2010（83）：924～929.

13 田颖，黄挺，黎源倩刘军，等.高效液相色谱法同时测定多维元素片中9种水溶性维生素 ［J］.分析实验室，2010，29（11）：52～56.

14 A Lebiedzinska，M L Marszall，J Kuta，et al.Reversed－phase high－performance liquid chromatography method with coulometric electrochemical and ultraviolet detection for the quantification of vitamins B1（thiamine），B6（pyridoxamine，pyridoxal and pyridoxine）and B12in animal and plant foods［J］.Journal of Chromatography A，2007，1 173（1～2）：71～80.

15 刘娜，陈大舟，汤桦，等.婴儿配方奶粉中8种水溶性维生素的高效液相色谱同时测定［J］.分析测试学报，2008，27（4）：408～411.

16 B A Bowman，R M Russell.现代营养学［M］.北京：北京化学工业出版社，2004：270～273.

17 李碧春，赵东伟，王克华，等.鸡胚胎及其部分组织器官生长发育的研究［J］.江苏农业研究，2001，22（2）：39～43.

Detection of water－solution vitamins in embroynated eggs and its changes during incubate

FAN Liang1，2ZHANG Yu1CHEN Li－jun1JIANG Tie－min2

（1.Dalian Polytechnology University，Dalian，Liaoning116034，China；2.Beijing Sanyuan Co.，Ltd，Beijing100085，China）

The assessment and validation of reliable and analytical method for the determination of water－solution vitamins，The recovery of the five kinds of vitamins are more than 90%and it appears a very good linearity during 0.1～50μg/mL。A RP－HPLC method was put to use to detect five water－soluble vitamins（riboflavin，、niacin、niacinamide、pyridoxin folic acid）in different incubate period（the 0th，2th，4th，6th，8th，10th，12th，14th，16thand 18thday after incubate）embroynated eggs and made a comparison with the fresh egg，the results indicated that as the incubate goes on，the content of riboflavin、niacin and folic acid had made a increase at different level，the content of niacin in the 18thday of embroynated eggs is 3.2times than fresh eggs，as to riboflavin，this amount is 31%，the biggest content of folic acid appears the 12thday，it is the twice amount of the fresh eggs，both of the pyridoxin and niacinamide were below the limit of detection.

embroynated eggs；water－solution vitamin；riboflavin；niacin；folic acid

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.010

国家“863”计划（编号：2011AA100903）；北京市科技计划（编号：D10110504600000）

范亮（1985－），男，大连工业大学在读硕士研究生。E－mail：fanliang24233＠163.com

陈历俊

2011－12－01