黑曲霉发酵法辅助提取芒萁黄酮及其抗氧化研究

曾 伟 丁利君 黄聪华 黎银珠

（广东工业大学轻工化工学院，广东 广州 510006）

黑曲霉发酵法辅助提取芒萁黄酮及其抗氧化研究

曾 伟 丁利君 黄聪华 黎银珠

（广东工业大学轻工化工学院，广东 广州 510006）

该试验旨在确定黑曲霉发酵法辅助提取芒萁黄酮的最佳提取工艺，并探讨其抗氧化性。采用黑曲霉发酵法制备混合酶液的方法，通过单因素试验、正交试验确定提取芒萁黄酮的最佳条件，并通过测定芒萁黄酮对羟基自由基、DPPH的清除作用和还原力的分析，对其抗氧化活性进行研究。结果表明，黑曲霉发酵法制备复合酶液，提取芒萁黄酮的最佳条件为加酶量2.5mL，pH 5.0，于70℃下酶解2h；黑曲霉产复合酶辅助提取率最高，由不加酶的6.66%提高到11.67%，芒萁黄酮提取物有良好的清除羟基自由基的能力。

芒萁；黄酮；黑曲霉；抗氧化

芒萁（dicranopteris linearis），又名铁狼萁，是水龙骨目里白科芒萁属的蕨类植物，广泛分布于中国长江以南各省区。芒萁有很好的药用价值，其根茎及叶可治冻伤，能清热解毒，袪瘀消肿止血［1］。它含有糖类、有机酸、黄酮类、皂苷、强心苷、蒽醌类等有效成分，特别是总黄酮含量丰富。研究［2，3］表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、防止心血管疾病、消炎、抗过敏、镇痛、抗菌、抗病毒等作用。目前，提取黄酮类化合物的方法很多，如有机溶剂提取［4］、超声波［5］、超临界流体萃取［6，7］、微波法［8］、酶法［9，10］等，而未见发 酵法辅助提取黄酮的相关报道。该法通过微生物发酵法产生复合酶制剂，并以之分解植物细胞壁中的木质素、纤维素等大分子物质，促进有效成分的浸出，相对超声波、超临界流体萃取、微波法而言，设备简单，成本低。故本试验采用微生物发酵法辅助提取芒萁黄酮，优化其提取工艺，分析其抗氧化活性，为芒萁资源的开发与利用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

芒萁：采摘于广州大学城。将新鲜芒萁去杂洗净，于80℃烘干后粉碎，过80目筛，密封保存，备用。

芦丁：上海润捷化学试剂有限公司；

邻苯三酚：分析纯，天津福晨化学试剂厂；

其他试剂：均为国产分析纯；

黑曲霉：由广东工业大学轻工化工学院学院微生物实验室提供；

固体发酵基础培养基：麸皮10g（250mL三角瓶），水15mL，参照文献［11］制备。

1.2 主要仪器

双光束紫外可见分光光度仪：TU－1901，北京普析通用仪器有限责任公司；

微波消解仪：XT－9900型，上海新拓微波溶样测试技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 制备混合酶液 斜面培养方法挑取黑曲霉斜面保藏菌种，接于斜面培养基培养后，用无菌水将斜面上的孢子洗下。将1mL孢子悬液接入固体发酵培养基，于600r／min 35℃条件下震荡培养4d，50℃干燥48h，粉碎，过60目筛，制成粉状干菌备用。称取0.500g粉状干菌，加20mL水溶解，磁力搅拌10min，用水定容至50mL，摇匀，在4℃下存放2d，过滤，得混合酶液，备用［12，13］。

1.3.2 总黄酮含量的测定 参照文献［8］。

1.3.3 芒萁黄酮对羟基自由基的清除作用 根据文献［14］修改如下：在10mL试管中依次加入9mmol／L Fe2＋1mL，8.8mmol／L H2O21mL，摇匀，静置10min；取不同浓度的样品溶液2mL，摇匀，静置10min，再加入9mmol／L水杨酸－乙醇溶液1mL，摇匀，静置30min后，于510nm处测其吸光值，其清除率按式（1）计算：

式中：

E——羟基自由基的清除率，%；

A0——空白对照液的吸光值；

Ax——加入不同黄酮浓度样品的溶液吸光值；

Aj——不加水杨酸的吸光值。

在文献［14］的基础上，式（1）中引入Aj是为了消除样液本身对测定结果的干扰。

1.3.4 芒萁黄酮对DPPH的清除作用 根据文献［15］修改如下：取不同黄酮浓度的样品（0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12mg／mL）1mL，与 0.5mmoL／mL 的 DPPH 溶 液0.25mL混合，加乙醇至10mL，在黑暗中37℃放置20min，在517nm 测定其吸光值Ai；0.5mmol／mL DPPH 溶液0.25mL与1mL乙醇混合，摇匀，加乙醇至10mL，在黑暗中37℃放置20min，在517nm测定其吸光值A0；不同浓度样品1mL与0.25mL乙醇混合，摇匀，加乙醇至10mL，在黑暗中37℃ 放置20min，在517nm测定其吸光值Aj。以乙醇为空白调零。其抑制率按式（2）计算：

式中：

I—— 抑制率，%；

A0——空白对照液的吸光值；

Ai——加入不同浓度样品的溶液吸光值；

Aj——样液在测定波长的吸光值。

在文献［15］的基础上，在式（2）中引入Aj是为了消除样液本身对测定结果的干扰。

1.3.5 芒萁黄酮对还原力的影响 参照文献［16］。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉发酵法提取芒萁黄酮的单因素试验结果

2.1.1 温度对芒萁黄酮提取效果的影响 准确称量芒萁粉末5.0g，加入酶液2.5mL，无菌水100mL，pH 7，分别于23（室温），30，40，50，60，70℃下浸提1.5h后，抽滤，定容至250mL，测定总黄酮含量，分析提取温度对芒萁黄酮提取量的影响。由图1可知，随着浸提温度的提高，芒萁黄酮的提取率逐渐增加；在60℃后，提取率增加幅度变小，以下试验选取60℃为提取温度。

图1 提取温度对芒萁黄酮提取效果的影响Figure 1 The influence of the temperature of extraction of flavonoid from Dicranopteris linearis

2.1.2 浸提时间对芒萁黄酮提取效果的影响 准确称量芒萁粉末5.0g，加入酶液2.5mL，无菌水100mL，于pH 7，60℃下分别浸提0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，抽滤，定容至250mL，测定总黄酮含量，分析浸提时间对芒萁黄酮提取量的影响。由图2可知，随着浸提时间的增加，芒萁黄酮提取量也呈增加趋势，但浸提时间超过1.5h后，增幅变小，以下处理中，均采用1.5h提取。

图2 提取时间对芒萁黄酮提取率的影响Figure 2 The influence of the time of extraction of flavonoid from Dicranopteris linearis

2.1.3 酶液添加量对提取效果的影响 准确称量芒萁粉末5.0g，酶液添加量分别为0，15，20，25，30，35mL，无菌水100mL，于pH 7，60℃下浸提1.5h，抽滤，定容至250mL，测定总黄酮含量，确定加酶液的量对芒萁黄酮提取量的影响。由图3可知，加入酶液，芒萁黄酮提取率增加；随着加酶量的增加而增加，增加到1.5mL后，芒萁黄酮提取率的增幅逐渐减小。

2.1.4 pH值对芒萁黄酮提取效果的影响 准确称量芒萁粉末5.0g，加入无菌水100mL，分别调节pH 值至4，5，6，7，8，并加入黑曲霉酶液1.5mL于60℃下浸提1.5h，测定总黄酮含量，分析pH值对芒萁黄酮提取量的影响。由图4可知，黑曲霉在pH值为5时，芒萁黄酮的提取量达到最高。

图3 酶液量对芒萁黄酮提取效果的影响Figure 3 The inluence of enzyme volume on extraction of flavonoid from Dicranopteris linearis

图4 pH值对芒萁黄酮提取效果的影响Figure 4 The influence of pH value on extraction of flavonoid from Dicranopteris linearis

2.2 黑曲霉提取芒萁黄酮正交试验及其结果

采用黑曲霉制备复合酶用于辅助提取芒萁黄酮，考虑到各因素之间的相互作用，在单因素试验的基础上，对提取温度、浸提时间、加酶量、pH值进行四因素三水平的正交试验，从中确定微生物辅助提取芒萁黄酮的最佳提取条件，因素水平见表1，试验设计及结果见表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

由表2可知，最优组合是A3B3C3D2，即温度为70℃、加酶量为3.5mL、时间为2h、pH值为5.0。各因素对芒萁黄酮提取率的影响大小顺序为A＞B＞C＞D，即提取温度对芒萁黄酮提取率的影响比较大，主要是因为温度对酶活有较大的影响。综合考虑各方面的影响，pH值选择5.0，加酶量为2.5mL，即最佳提取条件为加酶量2.5mL，pH 值5.0，于70℃酶解2h。黑曲霉发酵产生的复合酶，具有多种活性较强的酶系，如纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、蛋白酶等，可将原料中的纤维素等大分子化合物降解，从而破坏植物的细胞壁，促进有效成分的提取。验证实验表明，在温度为70℃、加酶量为2.5mL、时间为2h、pH值为5.0的条件下，芒萁黄酮的提取率为11.67%。

表2 L9（34）正交试验设计及结果Table 2 Analyze and results of the L9（34）orthogonal array design

2.3 芒萁黄酮的抗氧化试验结果

2.3.1 芒萁黄酮对·OH清除作用 由图5可知，对羟基自由基的清除率随着芒萁总黄酮的增加而增加，其IC50为1.22mg／mL。表明芒萁黄酮对清除羟基自由基具有较好的效果，有良好的抗氧化作用。

图5 芒萁黄酮对羟基自由基的清除作用Figure 5 The influence of D.dichotoma flavonoids on·OH

2.3.2 芒萁黄酮对DPPH清除能力 由图6可知，随着芒萁黄酮浓度的增加，对DPPH清除能力随之提高，芒萁黄酮表现出一定的对DPPH清除能力。

图6 芒萁黄酮对DPPH的清除效果Figure 6 The influence of D.dichotoma flavonoids on DPPH

2.3.3 芒萁黄酮对还原能力的影响 由图7可知，芒萁黄酮的还原力随其浓度的增加而增加，表明芒萁黄酮有较强的给予电子的倾向，使自由基转变成更稳定的状态，从而实现其抗氧化作用。

图7 芒萁黄酮对还原力的影响Figure 7 The effect of D.dichotoma flavonoids on reducing power

3 结论

采用黑曲霉发酵制取复合酶，辅助提取芒萁黄酮，不但可以有效提高黄酮得率，还可以大大降低生产成本，为芒萁的进一步开发提供了科学依据。芒萁黄酮有很好的抗氧化性。关于芒萁黄酮的具体结构还需要进一步研究探讨。

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Study on extraction of flavonoids fromdicranopteris linearisassisted withAspergillusniger fermentation and its antioxidant research

ZENG Wei DING Li－jun HUANG Cong－huaLI Yin－zhu

（School of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou，Guangdong510006，China）

The flavonoids ofdicranopteris lineariswas extracted with enzyme－assisted method of fermentation ofAspergillus，the optimum extraction process was determined，and its antioxidant activity was researched. Methods：the mixed enzyme was prepared withAspergillusfermentation，the best extraction conditions were determined by single－factor experiments and orthogonal test，and its antioxidant activity was analyzed.Results：the optimum extraction conditions were the amount of enzyme to 2.5mL，pH value of 5.0，at 70℃for 2h.Aspergillusenzyme－assisted extraction produced the highest rate，increased from 6.66%（without enzyme）to 11.67%，The flavonoids had good scavenging ability to hydroxyl radicals，and had good antioxidant activity and good prospects of development.

dicranopteris linearis；flavonoids；aspergillus；antioxidant

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.032

广东省自然基金项目（编号：8151009001000029；10151009001000011）；广东省科技厅计划项目（编号：2008B021100013）

曾伟（1986－），男，广东工业大学在读硕士研究生。E－mail：f12593006＠126.com

丁利君

2012－02－10