艾灸足三里等穴诱导HSP60对急性胃黏膜损伤大鼠Smac表达的影响

郁 洁，彭 宏，林亚平，易受乡

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208）

艾灸足三里等穴诱导HSP60对急性胃黏膜损伤大鼠Smac表达的影响

郁 洁，彭 宏，林亚平，易受乡

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208）

目的 观察艾灸足阳明胃经“足三里”等穴对急性胃黏膜损伤模型大鼠HSP60、Smac表达的影响，探讨艾灸足阳明经穴抗胃黏膜损伤的保护性机制。方法 24只SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、艾灸穴位组，8只/组。大鼠艾灸预处理8 d，进行无水乙醇灌胃，制作急性胃黏膜损伤大鼠动物模型。用免疫组化方法检测HSP60及Smac表达。结果 与空白对照组相比，模型对照组大鼠Smac、HSP60表达均显著升高差异有统计学意义（P＜0.01）；艾灸穴位组HSP60表达明显上调（P＜0.01），而Smac表达明显被抑制（P＜0.01）。与模型对照组相比，艾灸穴位组Smac表达明显下降（P＜0.01），HSP60表达显著提高差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 艾灸足阳明经穴预处理可以诱导保护性蛋白HSP60的过度表达，抑制促凋亡因子Smac表达，从而起到保护胃黏膜损伤的作用。

艾灸；胃黏膜损伤； HSP60；Smac

急性胃黏膜损伤（Acute Gastric Mucosal Lesion，AGML ）又名急性出血性糜烂性胃炎[1]，近年来的发病率呈逐年上升趋势，寻求预防本病的有效方法已成为临床亟待解决的问题之一。研究已表明，针灸对胃黏膜的保护不仅具有抗损伤作用，同时还能促进溃疡表面修复和愈合。本实验课题通过探讨艾灸预处理对胃黏膜损伤后HSP60和Smac表达的影响，以期揭示艾灸足阳明经穴预处理对急性胃黏膜损伤的内源性保护机制，为临床防治胃黏膜病变提供实验依据。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级健康SD大鼠24只，雌雄各半，体质量180～220 g。由上海西普-比凯尔实验动物有限公司提供。

1.1.2 主要实验仪器 艾条（中国南阳市卧龙汉医艾绒厂，型号：mg-454，规格：18×200mm）；自制艾灸支架；石蜡切片机（美国）；显微成像系统OLYMPUS Bx-70；Imagepro-Plus图像分析软件。

1.1.3 实验试剂 HSP60、Smac免疫组化法试剂盒（北京·中杉）

1.2 方法

1.2.1 动物分组 24只大鼠随机分为3组，每组8只。即：空白对照组（A组）、模型对照组（B组）、艾灸穴位组（C组）。

1.2.2 穴位定位 根据《实验针灸学》大鼠穴位定位方法及拟人比照法，取足三里和中脘穴。

足三里：膝关节后外侧，在腓骨小头下约5mm处。

中脘：以胸锁联合和耻骨联合连线下1/4与上3/4交点为肚脐，再以胸剑联合到肚脐连线中点。

1.2.3 艾灸方法 大鼠仰卧位束缚于鼠板上，定穴剪毛，将艾条固定于自制艾炷支架上，使艾条燃烧部位垂直距离穴位约3 cm，点燃施灸，艾灸30min/（d·穴），连续艾灸8 d。

1.2.4 造模方法 以95%无水乙醇灌胃（0.6mL/100 g） 10 h。

1.2.5 实验步骤 空白对照组和模型对照组捆绑处理30min/天；艾灸穴位组艾灸中脘穴和一侧足三里穴30min/d，左右交替。各组处理8 d后，大鼠禁食不禁水24 h，继以无水乙醇灌胃10 h，摘取胃组织，检测各项指标。

1.2.6 胃组织标本处理和检测 用棉线结扎胃幽门部，将4%多聚甲醛5 mL，自食道注入胃内后，结扎贲门，在两结扎线的两端切断食道及十二指肠，摘下全胃，10min后沿胃大弯剖开，生理盐水将胃内容物冲洗干净，定性滤纸吸干生理盐水，然后在胃窦部取约0.5 cm×0.5 cm大小组织块放入4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋备用。分别按照HSP60和Smac试剂盒说明书检测。

用PBS代替一抗作阴性对照。HSP60、Smac蛋白阳性判定标准为细胞浆或细胞核中出现棕黄色细颗粒状。采用Imagepro-Plus图像分析软件，光镜下10×40倍，每张切片随机分析5个视野，计算HSP60和Smac数密度（阳性细胞数/统计场面积），取其平均值作为结果。

1.3 统计学分析

所有数据使用SPSS14软件进行分析，用“x±s”表示。所有资料进行正态性检验；符合正态分布者，多组计量资料采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐者用LSD法，方差不齐者用Tamhane’s T2法；不符合正态分布者采用秩和检验。

2 结果

2.1 艾灸对急性胃黏膜损伤大鼠HSP60表达的影响

与空白对照组相比，模型对照组HSP60表达明显升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01），说明无水乙醇灌胃，引发胃黏膜应激反应，机体HSP60表达升高。与模型对照组相比，艾灸穴位组HSP60表达明显升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），说明艾灸预处理可诱导HSP60过度高表达。结果见表1。

表1 各组大鼠胃黏膜HSP60的表达（x±s，n=8）

2.2 艾灸对急性胃黏膜损伤大鼠Smac表达的影响

模型对照组大鼠Smac表达明显高于空白对照组（P＜0.01），提示无水乙醇灌胃造成胃黏膜损伤，导致胃黏膜细胞Smac表达上调。与其他两组相比，艾灸穴位组Smac表达显著下调（P＜0.01），提示艾灸足阳明胃经“足三里”等穴预处理可以下调Smac表达，结果见表2。

表2 各组大鼠胃黏膜Smac的表达（x±s，n=8）

3 讨论

胃黏膜损伤在中医属于“胃痛”、“呕吐”范畴，主要是由寒邪客胃、饮食伤胃、肝气犯胃、脾胃虚弱等病因引起。现代医学认为，胃内环境恶化、胃黏膜损伤是胃病的主要发病机制。饮食中的许多成分如乙醇等，均可能刺激损伤胃脏。热休克蛋白（heat shock protein，HSP）[1]是一类高度保守的应激蛋白，在许多应激状态下（如高温、缺氧、病毒及细菌感染、重金属感染等）表达可高达15%以上。急性胃黏膜损伤时，依照细胞适应性保护原则，胃黏膜上皮细胞能积极调整保护机制，促进HSP合成。HSP60不仅可以作为一个分子伴侣，同时还可以参与细胞凋亡[2-3]。张红艳等通过热休克预处理诱导HSP60过量表达减轻了严重烧伤诱导的大鼠急性胃黏膜损伤[4]。课题组在以往关于家兔胃黏膜损伤的研究中发现，艾灸足三里、梁门穴预处理可促进束缚水浸应激所造成大鼠胃黏膜损伤的修复[5]、胃黏膜增值加强[6]。本实验观察到，无水乙醇造模后，模型对照组胃黏膜HSP60表达显著高于空白对照组，提示在急性外来刺激下，大鼠胃黏膜HSP60应激性表达增加。而艾灸中脘、足三里穴组胃黏膜中HSP60过度高表达，提示艾灸中脘、足三里穴可诱导急性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜中HSP60的高表达，从而保护胃黏膜。

线粒体促凋亡蛋白（Smac）也称为DIABLO （direct IAP binding protein with low PI），是2000年发现的一种由线粒体释放的促凋亡蛋白，参与细胞凋亡线粒体通路下游反应，促进细胞凋亡的发生[7]。已有研究资料表明，艾灸对应激性胃溃疡大鼠的影响，发现艾灸足三里、梁门穴后大鼠胃黏膜增殖细胞核抗原（ PCNA） 增加，细胞凋亡指数下降[8]。但关于艾灸与Smac表达的研究比较少。本次实验数据表明，模型对照组Smac明显高于空白对照组（P＜0.01），表明胃黏膜损伤可诱导Smac表达，而艾灸穴位组Smac表达明显减少，说明艾灸可以抑制Smac表达。

本实验从“艾灸中脘、足三里穴诱导HSP60表达→抑制Smac表达→保护胃黏膜损伤”的思路出发，比较了艾灸足阳明经穴对急性胃黏膜损伤大鼠HSP60和Smac表达的影响，初步探讨了艾灸预处理促进急性胃黏膜损伤修复的内在机制，为艾灸预防急性胃黏膜损伤提供了实验依据。

[1]李润玖,李 锐,张 彧.热休克蛋白生物学功能及其在肾损伤中作用的研究进展[J].中国急救复苏与灾害医学杂志,2008,3(2):121-125.

[2]陈演江,肖德生,汪凤维,等.艾灸对大鼠胃溃疡模型的影响[J].针刺研究,1992,17(2):113-116.

[3]孙茂峰,王茵萍.针灸保护胃黏膜临床与实验研究进展[J].中国针灸,2000,20(7):441-445.

[4]张红艳,吕农华,谢勇,等.HSP60和HSP70在严重烧伤大鼠胃黏膜的表达及对胃黏膜的保护作用[J].江西医学院学报,2008,48(2):34-38.

[5]易受乡,彭 艳,常小荣,等.艾灸预处理对应激性溃疡大鼠胃黏膜增殖修复的影响[J].世界中西医结合杂志,2007;2(1):21-24.

[6]易受乡,彭 艳,常小荣,等.艾灸对应激性胃溃疡大鼠胃黏膜细胞增殖和凋亡的影响及其与热休克蛋白表达关系的研究[J].针刺研究,2006,31(5):259-263.

[7]Verhagen AM,Ekert PG,Pakusch M,et al.Identification of DIABLO,a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins[J].Cell,2000,102:43-53.

[8]常小荣,彭娜,易受乡,等.艾灸足三里和梁门穴诱导热休克蛋白70抗大鼠胃黏膜氧化损伤作用[J].世界华人消化杂志,2006,14(35):3405-3408.

Effects of moxibustion on acupoint Zusanli and the expressions of HSP60 and Smac in acute gastric mucosal lesion of rats

YU Jie, PENG Hong , LIN Ya-ping, YI Shou-xiang
(School of Acupuncture & Moxibustion and Massotherapy, Hunan College of Traditional Chinese Medicine, Hanpu Science & Education District, Changsha, Hunan 410208，China)

moxibustion; gastric mucosal lesion; heat shock protein 60; Smac

R245

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.08.006.014.03

〔Absrract〕Objective To observe the effects of moxibustion pre-treatment at Zusanli and Zhongwan acupoints on expressions of heat shock protein (HSP)60 and Smac in a rat model of acute gastric mucosal lesion (AGML) and explore the underlying protective mechanisms of moxibustion for gastric mucosal lesion. Methods A total of 24 Sprague Dawley rats were divided into 3 groups, i.e. blank, model and moxibustion acupoint (n=8 each). After an 8-day moxibustion pretreatment, the gastric lavage of anhydrous ethanol was used to establish the AGML model. The immunohistochemistry was used to examine the expressions of HSP60 and Smac. Results As compared with the blank group, the expressions of Smac and HSP60 were markedly elevated in the model groups (P＜0.01); The expressions of HSP60 was markedly elevated in the moxibustion acupoint group (P＜0.01) while those of Smac became obviously suppressed (P＜0.01). As compared with the model group, the expressions of Smac decreased significantly in the moxibustion acupoint group (P＜0.01) while those of HSP60 increased markedly (P＜0.01). Conclusion The pre-treatment of moxibustion could alleviate the gastric mucosal lesion caused by anhydrous ethanol, induce the over-expressions of HSP60 and down-regulate the expression of Smac so as to protect against gastric mucosal lesion.

2012－03－09

国家自然科学基金项目（81072867，307727707）、湖南省教育厅项目（10C1034）资助。

郁 洁（1979－）女，博士，讲师，主要研究方向：针灸治病机理的研究。

林亚平（1956－），女，湖南长沙人，教授，硕士研究生导师，Email:lyplinda@yahoo.com.cn

（本文编辑 韩志涛）