猪皮胶原蛋白水解物体外抗氧化作用模式初探*

张慧芸，陈俊亮，康怀彬，杨芳宁

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳，471003)

已有的研究表明，抗氧化生物活性肽具有清除体内自由基的功能，是一种潜在的可以利用的外源性抗氧化物质［1－2］。国内外已从河豚鱼皮［3］、鱿鱼皮［4］、斑点叉尾鮰鱼皮［5］、毛鳞鱼［6］、阿拉斯加鳕鱼皮［7］等多种鱼类中提取出胶原蛋白抗氧化肽，且经研究具有较好的抗氧化性。近年来，有关动物蛋白质水解制备抗氧化活性肽的研究逐步增多。猪皮中蛋白质含量高达33%，其中胶原蛋白含量为87.8%［8］。目前，国内外对猪皮胶原蛋白抗氧化肽的研究主要集中在利用单一酶或者复合酶水解来提高水解度和优化水解条件等方面以提高其利用率或抗氧化活性［9－12］，但是对于猪皮胶原蛋白水解物体外抗氧化作用机制的研究相对较少。

本试验是以猪皮胶原蛋白为底物，采用胃蛋白酶水解胶原蛋白，制得胶原蛋白肽，采用不同的抗氧化体系对猪皮胶原蛋白水解物还原能力、自由基清除能力、抗脂质过氧化能力、金属离子螯合能力进行系统的研究，以期探讨猪皮胶原蛋白水解物的体外抗氧化作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜猪皮(购于洛阳大张超市)，胃蛋白酶(1∶3 000，Sigma)，大豆卵磷脂、抗坏血酸钠、丁基羟基茴香醚(BHA)、DPPH自由基，Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机，H2050R湘仪离心机仪器有限公司;真空冷冻干燥机，GLZ－0.2上海浦东冷冻干燥设备有限公司;可见分光光度计，722S上海精密科学仪器有限公司;单光束紫外分光光度计，UV－7504上海欣茂仪器有限公司;微量高速离心机，TG16－W长沙湘仪离心机仪器有限公司;万分之一电子天平，JR2002上海市精密科学仪器有限公司;电热恒温水浴锅，HH－S江苏金坛市亿通电子有限公司;电热恒温干燥箱，303－1江苏省东台县安丰电器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 酶法提取猪皮胶原蛋白

参考周玉恵［11］和朱夕波［13］等人研究方法稍作修改。将新鲜猪皮洗净用手术刀去皮下脂肪切成0.5cm×0.5cm小块，用pH值7.5的磷酸盐清洗干净，再用去离子水浸泡冲洗，浸入质量分数10%的NaC1溶液中12 h，除去盐溶性杂质，用去离子水洗涤2～3次，然后分别加入0.5 mol/L的HAc(1/20，体积比)和胃蛋白酶(1/20，质量比)，控制pH在2～3内，酶处理72h后，离心(3 000 r/min)分离取上层清液。在上层清液中加人NaC1进行胶原蛋白盐析，离心分离(8 000 r/min)，沉淀即为胶原蛋白，将胶原蛋白溶解透析2～3 d，所得胶原蛋白沉淀冷冻干燥。

1.3.2 酶水解反应

将猪皮胶原蛋白与适量的水混合，配制成一定浓度(2%、3%、4%)，放入三颈瓶中，然后放入90℃水浴锅中预热5 min，用盐酸调节pH值为2，加入2.5/100(［E］/［S］)的胃蛋白酶，放置37℃水浴锅中开始反应，反应结束后在沸水浴中加热5 min灭酶，在8 000 r/min离心3 0min，取上清液用来测定抗氧化能力。

1.3.3 猪皮胶原蛋白多肽的还原能力测定

取0.5 mL样品溶液，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲溶液，2.5 mL l%铁氰化钾［K3Fe(CN)6］溶液，混匀，50℃保温 20 min，再加入2.5 mL 10%TCA溶液，振荡混匀后4 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%FeCl3溶液。静置10 min后体系溶液由黄色变为绿色，以等量去离子水代替样品溶液调零，在700 nm处比色。

1.3.4 猪皮胶原蛋白多肽的O－2·清除能力测定

参考张寒俊［14］等稍作修改。利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对O－2·的清除能力。取4.5 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液，加入0.2 mL样品溶液，于25℃保温 10 min．然后加入0.3 mL 25℃预温的3 mmol/L邻苯三酚，混匀后迅速加入干燥的比色皿中，在波长320 nm处测定吸光度。每隔30s测定1次吸光度值。以等量的10 mmol/L HCl代替邻苯三酚调零。空白组以等量的去离子水代替样液，其它步骤同前。

作出样品溶液与邻苯三酚，去离子水与邻苯三酚混合液在320nm处吸光度值随时间的变化曲线。其回归方程的斜率作为邻苯三酚的自氧化速率V样品、V空白(△OD/min)。

1.3.5 猪皮胶原蛋白多肽的抗脂质氧化能力测定［15］

取7.2 mL大豆卵磷脂溶液(0.4%)，加入0.8 mL水解液(2%)，加入0.8 mL FeSO4(10 mmol/L)催化氧化反应，混合后置于恒温水浴振荡器上，37℃保温15 min，然后加入2 mL三氯乙酸(20%)，5 000 r/min下离心10 min。取4 mL上清液，加入2 mL的硫代色比妥酸溶液(0.8%)，摇匀后沸水浴15 min，于532 nm处测定吸光值。

式中:A0，空白对照液的吸光度;Ax，加入样品溶液后的吸光度。

1.3.6 对金属离子的鳌合能力测定

参照Wang等［16］的方法。(1)对Cu2+的鳌合:用邻苯二酚紫(PV)作为金属螯合指示剂。向1 mL 2 mmol/L的 CuSO4溶液、1 mL 10%的吡啶与 20 μL 10%的PV混合物中添加1 mL的猪皮胶原蛋白质水解物，PV与CuSO4结合形成蓝色物质，在有螯合剂存在时PV与Cu2+分离，溶液蓝色消失。PV溶液颜色的变化可以在632 nm处测量。(2)对Fe2+的螯合:1 mL20 μmo1/L的FeCl2与1 mL 0.5 mmo1/L的ferrozine混合后会产生一种物质，在562 nm处有强吸收。向其中添加0.5 mL的猪皮胶原蛋白质水解物，由于Fe2+被鳌合，溶液颜色发生变化，在562 nm下读取吸光值。猪皮胶原蛋白水解物对金属离子的螯合作用按公式(1)计算:

2 结果与分析

2.1 猪皮胶原蛋白水解物的还原能力

由图1所示，与未水解的猪皮胶原蛋白质相比，猪皮胶原蛋白质的水解物具有较高的还原能力。而且随着蛋白浓度的增加其水解物还原能力逐渐增强。对于不同浓度的猪皮胶原蛋白质水解物，其还原能力均随着水解时间的延长而增加，到6 h时，其还原能力达到最大，即抗氧化活性最强，而此后随着时间的延长，还原能力开始下降，由此可得出猪皮胶原蛋白蛋白水解物抗氧化活性与水解时间并不呈线性关系，不是水解时间越长，抗氧化能力越强。

图1 不同水解时间和不同蛋白浓度对猪皮胶原蛋白水解物还原能力的影响

2.2 猪皮胶原蛋白水解物的清除·能力

由图2所示，与未水解的猪皮胶原蛋白比较，猪皮胶原蛋白质水解物具有较高的清除O－2·能力。这是由于水解后蛋白质结构的变化而导致了猪皮胶原蛋白水解物具有了很强的清除自由基能力。随着蛋白浓度的增加其清除O－2·的能力逐渐增强，4%猪皮胶原蛋白质水解物在水解6h时其清除O12·的能力达到了55%左右，未水解的猪皮胶原蛋白质仅5%左右。对于不同浓度的猪皮胶原蛋白质水解物，水解时间在0.5～6 h时，其清除O－2·的能力随着水解时间的延长而增加;水解时间大于6 h，其清除O12·的能力随着水解时间的延长开始下降。

图2 不同水解时间和不同蛋白浓度对猪皮胶原蛋白水解物清除能力的影响

2.3 猪皮胶原蛋白水解物的抗脂质过氧化能力

由图3所示，与未水解的猪皮胶原蛋白质相比，猪皮胶原蛋白质的水解物具有较高的抗脂质过氧化能力。而且随着蛋白浓度的增加其水解物抗脂质过氧化能力逐渐增强，4%猪皮胶原蛋白质水解物在水解6 h时抗脂质过氧化能力达到34%左右，未水解的猪皮胶原蛋白质仅6%左右。对于不同浓度的猪皮胶原蛋白质水解物，其抗脂质过氧化能力随着水解时间的延长而增加，到6 h时，其抗脂质过氧化能力达到最大，此后随着时间的延长，抗脂质过氧化能力开始下降。

图3 不同水解时间和不同蛋白浓度对猪皮胶原蛋白水解物抗脂质过氧化能力的影响

2.4 猪皮胶原蛋白水解物的金属离子螯合能力

由图4、图5可知，猪皮胶原蛋白质具有螯合Cu2+和Fe2+的能力。而且，水解时间为0.5～6 h时，猪皮胶原蛋白质螯合Cu2+和Fe2+的能力均随着水解时间的延长而增加，而在水解6h之后，其鳌合能力呈现下降趋势。如未水解的猪皮胶原蛋白质(底物浓度为4%)到水解6h后的猪皮胶原蛋白质水解物，其螯合Cu2+的能力从5.15%增加到了36.72%，而且随着浓度的增加其螯合能力逐渐增强。螯合Fe2+的能力比螯合Cu2+的能力弱，Hara等［17］也得出，从一些植物和发酵粉中得到的蛋白质，螯合Cu2+的能力明显高于螯合Fe2+的能力。对于底物浓度为4%的水解6 h后的猪皮胶原蛋白其Fe2+的螯合能力仅为18.19%，在水解时间为0.5～6 h时，不同浓度的猪皮胶原蛋白质水解物，其螯合Cu2+和Fe2+的能力也是随着浓度的增加而增强。4%的猪皮胶原蛋白质水解6 h的水解物具有最强的螯合Cu2+和Fe2+的能力。

图4 不同水解时间和不同蛋白浓度对猪皮胶原蛋白水解物Cu2+螯合能力的影响

图5 不同水解时间和不同蛋白浓度对猪皮胶原蛋白水解物Fe2+螯合能力的影响

2.5 猪皮胶原蛋白水解物与其他抗氧化剂抗氧化能力的比较

猪皮胶原蛋白水解物与VC、BHT 2种抗氧化剂抗氧化能力的比较结果如表1。由表1可知，底物浓度为4%的猪皮胶原蛋白水解物的还原能力与0.02%VC差异不显著(P＞0.05)，且还原能力显著高于未水解的猪皮胶原蛋白(P＜0.05);0.02%VC的清除O2－·自由基能力比0.02%BHT、猪皮胶原蛋白水解物高(P＜0.05)，4%的猪皮胶原蛋白水解物清除O2－·自由基的能力高于0.02%BHT(P＜0.05);4%的猪皮胶原蛋白水解物的抗脂质过氧化能力低于0.02%VC、BHT，但远高于未水解产物的清除率。在金属离子螯合能力上，水解产物高于未水解的猪皮胶原蛋白质(P＜0.05)，0.02%VC和0.02%BHT对金属离子几乎没有螯合能力。猪皮胶原蛋白水解物的抗氧化效果除金属离子螯合能力外，都没有酚类抗氧化剂BHT效果好。

表1 猪皮胶原蛋白水解物与常用抗氧化剂之间的比较

3 讨论

随着水解的深入，肽链长度逐渐减小，更多的氨基酸残基和侧链基团暴露出来，如-NH2，-SH等以及脯氨酸、组氨酸等某些氨基酸，它们能与脂质氧化的不稳定产物、自由基等发生反应，或者能够捕捉活性氧，中止自由基连锁反应，即表现出一定的抗氧化作用［18］。在检测酶解猪皮胶原蛋白多肽抗氧化活性时，酶解0.5～6 h的产物抗氧化能力逐渐提高，可能与小分子肽段和游离氨基酸含量增加有关，所以在有限水解范围内，水解度越大，水解多肽的分子量越小，抗氧化活性越强［19］。

还原能力是表示抗氧化物质提供H·的重要指标，抗氧化物质通过提供H·可使自由基变为稳定的分子，从而失去活性。猪皮胶原蛋白酶解6h时，其还原能力达到最大，即抗氧化活性最强，这可能是由于蛋白肽链的断裂增加了有效的氢离子;而此后随着时间的延长，还原能力开始下降，这是因为随着水解过程的进行，水解度逐渐增大，水解产物中蛋白质、肽、游离氨基酸的组成、含量及氨基酸的排列顺序会发生相应的变化。

过渡金属离子(如Fe2+、Cu2+)能够催化活性氧(如·OH、O－2·)，从而氧化不饱和脂类。本实验结果表明，猪皮胶原蛋白水解物的Cu2+和Fe2+螯合能力随着水解度的增加而增强，4%猪皮胶原蛋白6 h水解物的Cu2+和Fe2+螯合能力最强，而不同浓度的猪皮胶原蛋白水解产物对Cu2+螯合能力高于对Fe2+螯合能力。这可能是由于肽键的断裂使羧基浓度增加，因此增加了金属离子螯合能力，从而清除了脂肪氧化体系的促氧化性的金属离子，还可能是由于某些暴露的氨基酸增加引起的，如组氨酸，它是常见的具有金属螯合能力的氨基酸［20］。

从本试验可以得出，猪皮胶原蛋白水解物具有较高的抗氧化活性，其抗氧化作用是从几个方面来实现的，包括提供氢离子来起到还原作用的能力、稳定和终止自由基的能力、抗脂质过氧化能力，以及清除和螯合金属离子的能力。

［1］ 冯怀蓉，张慧涛，茆军．多肽简介及应用［J］．新疆农业科学，2002，39(1):38－39．

［2］ Byun H G，Kim S K．Purification and characterization of angiotensin converting enzyme(ACE)inhibitory peptides from Alaska Pollack(Theragra chalcogramma)skin［J］．Process Biochemistry，2001，36:1155－1162．

［3］ 任俊凤，任婷婷，朱蓓薇．河豚鱼皮胶原蛋白多肽的提取及其抗氧化活性的研究［J］．中国食品学报，2009(1):77－82．

［4］ 秦玉青，刘承初，王慥，等．鱿鱼皮胶原蛋白的测定与回收［J］．上海水产大学学报，2002(11):138－144．

［5］ 刘海英．斑点叉尾鮰鱼皮胶原蛋白及胶原蛋白多肽的研究［D］．无锡:江南大学，2007．

［6］ Alarowicz R，Shahidi F．Antioxidant activity of peptide fractions of capel in protein hydrolysates［J］. Food Chemstry，1997，58(4):355－359.

［7］ Kim S K，Kim Y T，Byun H G，et al．Isolation and characterization of antioxidative peptides from gelatin hydrolysate of Alaska pollack skin［J］.J Agric Food Chem，2001，49(4):1 984－1 989.

［8］ 李开雄，赵志远，刘霞．猪皮中胶原蛋白的提取及其应用［J］．肉类研究，1996(4):43－48．

［9］ 班玉凤，朱海峰，马君昌．Alcalase水解猪皮胶原蛋白的研究［J］．现代食品科技，2004，21(2):59－61．

［10］ 王川，李燕，马志英，等．几种酶法从猪皮中提取胶原蛋白的对比研究［J］．食品科学，2007，28(1):201－204．

［11］ 周玉惠，叶正涛，肖立芳，等．猪皮胶原蛋白的提取及其结构表征［J］．湖北大学学报，2008(30):287－289．

［12］ Morimura S，Nagata H，Uemura Y et al.Development of an effective process for utilization of collagen from livestock and fish waste［J］.Process Biochemistry，2002，37:1403－1412.

［13］ 朱夕波，周培根，李燕，等．猪皮胶原蛋白水解产物中的抗氧化活性肽的分离及其氨基酸组分［J］．天然产物研究与开发，2009(21):122－124．

［14］ 张寒俊，杨国燕，张蕾，等．罗非鱼皮胶原蛋白肽酶解液的制备及其抗氧化特性研究［J］．中国酿造，2008(13):27－30．

［15］ Hua Ming Chen， Koji Muramoto， Fumio Yamauchi．Structural analysis of antioxidative peptides from Soybean β-conglycinin［J］．J Agric Food Chem，1995，43:574 －578．

［16］ Wang L L，Xiong Y L.Inhibition of lipid oxidation in cooked beef patties by hydrolyzed potato protein is related to its reducing and radical scavenging ability［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53:9 186－9 192.

［17］ Hara M，Fujinaga M，Kuboi T.Metal binding by citrus dehydrin with histidine-rich domains［J］.Journal of Experimental Botany，2005，56:2 695－2 703.

［18］ 凌关庭，抗氧化食品与健康［M］．北京:化学工业出版社，2004:5－6．

［19］ 刁静静，孔保华，刁新平，等．骨蛋白水解物抗氧化活性及其作用模式［J］.中国农业科学，2009，42(1):238－244．

［20］ 彭新颜，孔保华，熊幼翎.乳清蛋白水解物抗氧化活性的研究［J］. 食品科学，2009，30(3):167－172．