固定化铜绿假单胞菌生物降解对硝基苯酚

黄强，张明强

1.厦门大学嘉庚学院，福建 漳州 363105

2.漳州师范学院化学与环境科学系，福建 漳州 363000

硝基芳香族化合物作为重要的化工原料，广泛用于医药、染料、农药、塑料等行业，其在生产和使用过程中被释放到环境中，会对生态系统造成危害［1］，目前对含该类化合物的废水处理成为国内外学者的研究热点之一。对硝基苯酚(p-nitrophenol，PNP)是一种重要的环境污染物，已被我国列入水中优先控制污染物黑名单［2］，治理该类化合物对保证人类健康具有重要意义。对硝基苯酚类废水的处理方法有氧化还原法［3-4］、吸附法［5-6］和生化法［7-10］。利用生化法处理PNP废水具有效率高、成本低的优势。国外对其生物降解的研究已有较长的时间［11］，但是不同微生物的降解速度各不相同，分离不同的PNP降解菌株对研究PNP的生物降解机制具有重要的意义，其能为PNP污染的生物修复提供优良的材料。

固定化细胞技术作为现代化生物工程技术，是利用物理或化学手段将游离细胞定位于限定的空间领域，并使其保持活性，反复利用。与游离细胞方法相比，固定化技术克服了细胞太小，与水溶液分离较难，易造成二次污染等弊端，具有菌体密度高、反应迅速、菌体流失少、产物易分离、反应过程易控制等优点，是一种很有前途的污染物处理技术［12］。细胞被固定化后，细胞内酶系保存完整，相当于一个多酶生物反应器，可使反应更加充分彻底，所以固定化细胞技术被广泛应用［13-14］。

笔者采用海藻酸钠作细胞固定化的载体，以漳州某污水处理厂活性污泥中分离的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为固定化对象，研究了pH、温度、PDP初始浓度等对固定化细胞生物降解PNP效果的影响，并比较了游离细胞与固定化细胞在生物降解PNP过程中的活性。

1 材料与方法

1.1 试剂

试验所用PNP为化学纯试剂，其他各种药剂均为分析纯试剂。

无机盐培养液:(NH4)2SO4，1.0 g/L;K2HPO4，0.7 g/L;KH2PO4，0.3 g/L;MgSO4，0.2 g/L;NaCl，0.5 g/L;加入适量的PNP作为唯一碳源。

无碳无氮培养液:K2HPO4，0.7 g/L;KH2PO4，0.3 g/L;MgSO4，0.2 g/L;NaCl，0.5 g/L;加入适量的PNP作为唯一碳源和氮源。

富集培养基:蛋白胨，5 g/L;牛肉膏，3 g/L;NaCl，5 g/L。pH 为 7.4，121 ℃高压灭菌 20 min，该培养基用于菌株的扩大培养。

1.2 仪器与设备

UV-2102PC紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器厂);SHA-B恒温振荡器(常州国华科技仪器有限公司);TGL-16G台式离心机(上海浦东物理光学仪器厂);Sartorius电子天平(德国赛多利斯集团);AIR TECH超净工作台(北京格瑞恩科技发展有限公司);LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海中安医疗器械厂);PYX-250s-B生化培养箱(海口博艾森科技开发有限公司);Sartorius PB-10酸度计(德国赛多利斯集团);ML-902定时恒温磁力搅拌器(上海五相仪器仪表有限公司)。

1.3 菌种

P.aeruginosa从漳州某污水处理厂的活性污泥中分离获得，并鉴定保存。

1.4 分析项目

PNP浓度:取生物降解后的PNP培养液4 mL，12000 r/min离心10 min，取上清稀释一定倍数，用1 mol/L的HCl调pH为4.0，用紫外分光光度计扫描(200～400 nm)，观察特征峰(317 nm)的消失，并用标准曲线法计算PNP浓度及降解率(η):

式中，C0和C分别为降解前后PNP浓度，mg/L。

吸光度(A):采用紫外分光光度计在波长为600 nm下进行检测，以初始培养液(未接菌悬液时)为空白参比。

亚硝酸根采用对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺比色法［15］测定。

以上各试验均做3组平行试验，数值为3组平行试验结果的平均值。

1.5 试验方法

1.5.1 菌悬液的制备

将P.aeruginosa菌株活化并扩大培养，收集对数生长期［16］的湿菌体，8‰生理盐水洗涤后，以8000 r/min速度离心10 min，收集菌泥，将其制备成浓度为80%的菌悬液。

1.5.2 固定化细胞的制备

以海藻酸钠为载体，采用包埋法［17］制备固定化细胞，并通过正交试验优化固定化细胞的制备条件。按1 g菌悬液加入10 mL海藻酸钠胶液的比例充分混合均匀制成菌胶混合液，用直径为1.5 mm针头将菌胶混合液滴入4℃连续搅拌的30 mL CaCl2溶液中，形成凝胶颗粒，在4℃交联钙化一定时间后，得到直径为3～4 mm的固定化小球，该小球用8‰生理盐水洗涤2次，即可以使用。

1.5.3 固定化细胞的PNP生物降解试验

研究了pH、温度、PNP初始浓度对PNP生物降解效果的影响，并通过菌株生长曲线、降解时间动力学曲线及降解产物的测定，分析P.aeruginosa菌株的固定化细胞降解PNP的能力及活性。

2 结果与讨论

2.1 菌种生长周期测定

菌种的生长周期对菌株的固定化非常重要。图1为P.aeruginosa菌株的生长曲线。由图1可知，菌株在培养9 h后开始进入对数生长期，约22 h进入生长平衡期。因此，对该菌种进行固定化时，应选择其对数生长期(9～22 h)的种液，以保持其最高活性。

图1 P.aeruginosa菌株生长曲线Fig.1 The growth curve of bacterium Pseudomonas aeruginosa

2.2 正交法优化细胞固定化的最佳条件

影响固定化细胞降解效果的因素主要有包埋的菌体量、海藻酸钠胶液浓度、CaCl2浓度以及交联钙化时间。采用正交试验法，进行四因素三水平L9(34)正交试验［18］(表 1)，以 PNP 的降解率为指标进行最佳制备条件的确定。

表1 固定化细胞正交试验设计Table 1 Factors and levels of the cross-test experiments

按表1的因素和水平，采用1.5节方法制得9组固定化细胞(各组海藻酸钠胶液均为10 mL)，分别加入初始浓度为50 mg/L的PNP培养液25 mL，调节pH为8.0，培养温度30℃，120 r/min旋转摇床振荡42 h，测定PNP的降解率，结果如表2和表3所示。

表2 试验数据分析Table 2 Analysis of the experimental data

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

从表2和表3可以看出，各因素水平的最优组合为A3B2C1D3。即每mL海藻酸钠包埋的菌体量为0.3 g，海藻酸钠胶液浓度为3%，CaCl2浓度为4%，交联钙化时间为12 h。

2.3 pH的影响

将P.aeruginosa菌株的固定化细胞和与之菌量相等的湿菌体(游离细胞)分别接种于25 mL初始浓度为100 mg/L的PNP无机盐培养液中，调节pH 分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0，培养温度30℃，120 r/min旋转摇床振荡40 h，测定 PNP浓度，结果如图2所示。

图2 pH对PNP生物降解性能的影响Fig.2 Effect of pH on the performance of degrading PNP

考察pH对固定化细胞降解PNP效果影响的同时，还应考虑pH对固定化载体牢固程度的影响。当培养液pH调至10.0以上时，固定化载体的牢固程度下降，载体部分溶解。由图2可知，与游离细胞相似，固定化细胞降解PNP的最适pH为8.0～9.0。在各pH范围内，固定化细胞对PNP的降解能力均好于游离细胞。

2.4 温度的影响

将P.aeruginosa菌株的固定化细胞和与之菌量相等的湿菌体(游离细胞)分别接种于25 mL初始浓度为50 mg/L的PNP无机盐培养液中，调节pH为8.0，培养温度分别为 20、25、30、35、40 ℃，120 r/min旋转摇床振荡40 h，测定PNP浓度，结果如图3所示。

图3 温度对PNP生物降解性能的影响Fig.3 Effect of temperature on the performance of degrading PNP

考察温度对PNP生物降解活性的影响，对探讨该方法在不同环境温度的应用具有重要意义。由图3可知，在不同的温度下，固定化细胞对PNP的生物降解能力均好于游离细胞。与游离细胞相似，固定化细胞降解PNP的最适温度为30～35℃。

2.5 PNP初始浓度的影响

将P.aeruginosa菌株的固定化细胞和与之菌量相等的湿菌体分别接种于PNP初始浓度为25、50、100、150、200、250、300 和 350 mg/L 的 25 mL 无机盐培养液中，调节pH为8.0，培养温度为30℃，120 r/min旋转摇床振荡40 h，测定PNP浓度，结果如图4所示。

由图4可知，当PNP初始浓度为350 mg/L时，游离细胞的降解率接近于0，而固定化细胞的降解率为4.35%。与游离细胞相比，固定化细胞降解PNP耐受浓度有一定幅度的提高，这是由于在固定化系统中，PNP需扩散进入载体内部，才能被包埋在载体内的微生物细胞分解［19］。扩散作用使PNP浓度从载体外部到内部由高到低，形成浓度梯度［15］，减轻了PNP对载体内菌株的毒性，利于菌株对PNP的降解，并可加强其对PNP毒性的耐受力。

图4 PNP初始浓度对生物降解性能的影响Fig.4 Effect of different initial PNP concentration on PNP degradation

2.6 固定化细胞降解PNP的动力学曲线

将P.aeruginosa菌株的固定化细胞接种于初始浓度为50 mg/L的PNP无机盐培养液中，调节pH为8.0，培养温度为30℃，120 r/min旋转摇床振荡培养，进行固定化细胞降解PNP的时间动力学观察，结果如图5所示。

图5 固定化细胞降解PNP的时间动力学曲线Fig.5 Kinetic curve of degradation of PNP by immobilized cells

由图5可知，游离细胞与固定化细胞在PNP降解初期均有一段延滞期，游离细胞的延滞期约为38 h，固定化细胞的延滞期约为35 h。这是因为PNP对菌株的生长有抑制作用，即使是驯化后的菌株放入反应体系，也有一段适应期，所以在开始的一段时间PNP的降解速率很慢。而载体对于提高菌株的抗冲击能力具有一定的作用，所以固定化细胞的延滞期缩短。

固定化细胞的降解曲线分为0～35和35～42 h两段。随着菌株生长的开始(35～42 h)，PNP迅速被生物降解，约7 h生物降解完全结束。

将上述固定化细胞再次利用，在同样条件下生物降解PNP，其时间动力学曲线如图6所示。由图6可知，再次利用的固定化细胞，延滞期缩短为2 h，且生物降解速度明显升高，约6 h生物降解完全结束。

图6 再次利用固定化细胞降解PNP的时间动力学曲线Fig.6 Kinetic curve of degradation of PNP by reused immobilized cells

试验表明，固定化细胞连续使用3次效果稳定。当固定化细胞第4次利用时，载体的机械强度变差，固定化小球破裂。这可能是由于固定的菌株产生能分解海藻酸钠的酶，有待进一步探讨。

2.7 生物降解产物鉴定

采用对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺比色法鉴定PNP生物降解后的产物，结果表明，经生物降解后的溶液中存在中间代谢产物NO2-。当在无氮无碳培养基中加入PNP进行培养时，P.aeruginosa菌株的固定化细胞可利用释放的NO2-作为氮源进行生长。

3 结论

(1)采用正交法制备P.aeruginosa菌株固定化细胞，其最佳操作条件:每mL海藻酸钠包埋菌悬液量为0.3 g;海藻酸钠胶液浓度为3%;CaCl2浓度为4%;交联钙化时间为12 h。

(2)P.aeruginosa菌株固定化细胞对PNP的降解速度大于游离细胞，固定化细胞对PNP的耐受浓度比游离细胞高，这可能是由于在固定化系统中，扩散作用使PNP浓度从载体外部到内部由高到低，形成浓度梯度，减轻了PNP对载体内菌株的毒性，有利于菌株对PNP的生物降解，并可以加强其对PNP的耐受能力。

(3)P.aeruginosa菌株的固定化细胞随着外界pH的增加，对PNP的降解率逐渐增大，但当pH大于10.0，固定化载体会出现部分溶解，因此其生物降解的最适pH为8.0～9.0。此外，与游离细胞相似，固定化细胞降解PNP的最适温度为30～35℃。

(4)游离细胞与固定化细胞在生物降解初期均有一段延滞期，游离细胞的延滞期约为38 h，固定化细胞的延滞期约为35 h。这是因为载体对于提高菌株的抗冲击能力具有一定的作用，所以固定化细胞的延滞期缩短。

(5)采用对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺比色法鉴定PNP生物降解后的产物，结果表明，经生物降解后的溶液中存在中间代谢产物NO2-，这说明在无添加氮的情况下，P.aeruginosa菌株的固定化细胞可利用释放的NO2-作为氮源进行生长。

［1］沈标，李顺鹏，赵硕伟，等.氯酚、对硝基酚对土壤生物活性的影响［J］.土壤学报，1997，34(3):309-314.

［2］周文敏，傅得黔，孙宗光.水中优先控制污染物黑名单［J］.中国环境监测，1990，6(4):1-3.

［3］LI S X，ZHENG F Y，LIU X L，et al.Photocatalytic degradation of p-nitrophenolon nanometersize titanium dioxide surface modified with 5-sulfosalicylic acid［J］.Chemosphere，2005，61:589-594.

［4］梁宇宁，黄智，覃思晗，等.Cu2O光催化降解水中对硝基苯酚的研究［J］.环境污染治理技术与设备，2003，4(10):36-39.

［5］郭坌梅，马毅杰，韩和平.有机膨润土吸附对硝基苯酚的性能及其主要影响因素的探讨［J］.山西大学学报:自然科学版，2001，24(1):89-92.

［6］郝存江，冯青琴，元炯亮.改性蜂窝煤渣吸附水中对硝基苯酚研究［J］.化学世界，2004(4):320-323.

［7］高士祥，王灿，孔德洋，等.β环糊精对对硝基苯酚微生物降解的影响［J］.环境化学，2003，22(5):445-449.

［8］崔中利，张瑞福，何健，等.对硝基苯酚降解菌P3的分离、降解特性及基因工程菌的构建［J］.微生物学报，2002，42(1):19-26.

［9］刘智，张晓舟，何健，等.营养物质及金属离子对DLL-E4菌降解对硝基苯酚的影响［J］.土壤学报，2004，41(2):292-297.

［10］王灿，高士祥，杨光俊，等.环糊精对硝基化合物混合体系微生物降解影响［J］.中国环境科学，2004，24(4):429-432.

［11］SPONZA D T，KUSCU O S.p-Nitrophenol removal in a sequential anaerobic migrating blank reactor(AMBR)/aerobic completely stirred tank reactor(CSTR)system［J］.Process Biochemistry，2005，40:1679-1691.

［12］黄霞，俞毓馨，王蕾.固定化细胞技术在废水处理中的应用［J］.环境科学，1983，4(1):41.

［13］沈耀梁，黄勇，赵丹，等.固定化微生物污水处理技术［M］.北京:化学工业出版社，2002:166.

［14］马子骏，陆志号.固定化细胞技术及其应用［M］.银川:宁夏人民出版社，1989:100-101.

［15］李彦秋.固定化微生物处理低浓度含氮废水的研究［D］.南京:南京理工大学，2009.

［16］马艳玲.固定化假单胞菌降解油烟废气的研究［J］.环境工程学报，2009，3(10):1856-1860.

［17］王秀，张小平.固定化藻菌小球流化床光生物反应处理高浓度有机废水研究［J］.净水技术，2009，28(1):54-57.

［18］李春喜，王志和，王文林.生物统计学［M］.2版.北京:科学出版社，2000:277.

［19］MENKE B， REHM H-J.Degradation of mixtures of monochlorophenols and phenolas substrate for free and immobilized cells of Acaligenes sp.A7-2［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1992，37:655-661. ○