春兰根状茎多倍体诱导试验

徐晓薇，王丽芳，钱仁卷，杨燕萍

(浙江省农业科学院 亚热带作物研究所，浙江 温州 325005)

兰科植物的自然变异较为丰富，长期以来人们从采挖的大量植株中发现奇异单株，但这种从野生变异中选择品种的做法造成了兰花盲目、掠夺性的采挖，造成珍贵种质资源的外流。由于野生资源整体上趋于减少，自然变异产生的新品种数量也会变得越来越少。采用人工技术改良或创造新种质成了重要的方法之一，其中诱变技术是改良品种快速便捷的手段。本文以春兰的F1根状茎为材料，研究秋水仙素处理对春兰根状茎生长、分化和诱变效应，为春兰多倍体诱变育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以春兰F1根状茎继代繁殖几代后稳定生长的根状茎为材料。

1.2 方法

1.2.1 根状茎的浸泡处理

将生长较为一致的1 cm左右根状茎浸入到含不同浓度秋水仙素 (0，0.10%，0.20%)的溶液中，分别进行不同时间处理。A1-A4用0.05%秋水仙素分别处理 1，2，3，4 min;B1-B4用0.10%秋水仙素分别处理1，2，3，4 min;C1-C4用0.20%秋水仙素分别处理1，2，3，4 min;以清水为对照 (CK)。每处理6瓶，每瓶10个根状茎。处理条件为25℃，摇床转速90 r·min-1。

1.2.2 处理材料的培养和观察

将处理后的根状茎接到分化培养基 (1/2MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1)上，(26±1)℃下每天光照12 h。培养过程中观察根状茎的生长情况，记录根状茎受害率、分化率和生长状态等。受害率/%=受伤害的个体数/存活外植体数。分化率/%=分化出苗的个体数/存活外植体数。

诱导率/%=嵌和体+四倍体/取材数。

加倍率/%=四倍体/取材数。

将分化苗接到生根培养基 (1/2MS+NAA 2.0 mg·L-1+AC 2.0 g·L-1)上。

1.2.3 细胞学染色体的观察

取分化出苗的分裂增生能力强的原球茎或根尖，应用植物有丝分裂染色体压片技术制备标本。操作步骤如下:取根尖用饱和α-溴萘溶液4℃前处理24 h，固定液 (甲醇∶冰醋酸为3∶1)固定2 ～24 h，1 N HCl常温下解离5 min，60℃水浴解离3 min，染色，压片，镜检，拍照。对30个以上染色体分散良好的细胞进行染色体观察和计数，取其平均值作为该植株体细胞染色体的数目，用这种方法分别确定出二倍体植株和四倍体植株体细胞的染色体的个数。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素处理对原球茎生长和分化的影响

将秋水仙素处理过的原球茎在培养基上培养60 d后，转接到继代培养基上培养，观察统计其受害率和分化率 (图1)。

从图1可见，B4，C1，C4受害率明显高与对照，均达到了20%，其分化率在52.0% ～57.5%，也显著低于对照 (92.0%)。在相同浸泡时间处理时，秋水仙素浓度越高，其分化率越低。而采用相同浓度处理时，原球茎基本上随着浸泡时间的增加其分化率在逐步下降。这说明秋水仙素对原球茎生长和分化有抑制作用。

图1 秋水仙素处理对原球茎生长和分化的影响

2.2 秋水仙素处理的诱变效应

将处理后的原球茎接种到继代培养基上，部分原球茎增殖分化，新形成的部分明显比对照大，其分化出的植株粗壮，茎部明显变粗，这些植株可能是多倍体 (图2)。

图2 秋水仙素处理后再生植株表型及染色体变异

在处理后原球茎分化的植株中，还发现多叶、叶片变宽变厚、颜色加深、呈墨绿色、矮化等类型统计变异植株占取材植株的百分率 (表1)。

与对照相比，秋水仙素浓度处理除 A1外，其余的再生植株部分发生变异，不同浓度处理产生的植株变异百分率大小依次为 B3＞B2＞C2＞A3＞B1＞A4＞ B4＞A2＞C4＞C3＞C1，即秋水仙素浓度为0.10%，诱导率相对其他浓度要高;相同浓度不同时间处理时，当浓度为0.10%时，处理3 d的变异率最大为19%，且再生植株四倍体加倍率为处理3 d时间最高，达4% ～5%。崔广荣等［4］认为在相同时间的条件下，秋水仙素浓度越高，多倍体的诱变频率越高;反之亦然，在相同秋水仙素浓度处理条件下，处理时间越长，多倍体诱变频率也越高。

表1 秋水仙素处理后再生植株变异率

3 小结和讨论

以兰花原球茎和根状茎为材料进行多倍体诱导在国内外已有一些研究报道。但不同研究者由于采用的材料不同，处理方法不同，所得到的研究结果也不尽相同。Dolezel等［2］用秋水仙素对兰属杂种的原球茎进行处理，发现秋水仙素浓度、处理时间和多倍体诱导率之间不是简单的相关关系，用1 mg·mL-1秋水仙素处理7 d获得的四倍体最多;Hsien 等［2］用 125 mg·L-1秋水仙素处理 Dortis pulcherrima的原球茎，当原球茎直径为1.0～1.2 mm时，原球茎再生率为42% ～59%，再生植株中46%为四倍体;Kim等［4］用0.01%和0.05%秋水仙素处理寒兰根状茎，处理1周根状茎的存活率分别为82.3%和57.2%，在再生植株中0.01%处理2周、0.05%和0.10%处理1周的多倍体

(2n=66～80)诱导率分别为4.5%，5.2%，6.7%;李雪娇等［5］以野生碧玉兰试管苗为材料，0.04%的秋水仙素处理72 h效果最好，诱导变异率达60%，死亡率为30%。本试验结果表明，经秋水仙素处理的春兰根状茎分化率明显低于对照，再生植株的变异诱导率与秋水仙素浓度和处理时间无明显的简单相关关系，变异试管苗形态上表现为叶片变宽、叶色加深、叶面粗糙、植株矮壮，且生长缓慢。当秋水仙素浓度为0.10%、处理3 d时，诱导率最高为19%，同时四倍体加倍率处理3 d最大，但与秋水仙素的浓度处理差异不大，原因有待于进一步研究。

［1］ 崔广荣，张子学，张从宇，等.文心兰多倍体诱导及其鉴定 ［J］.草业学报，2010(1):184-190.

［2］ Dozel J， Novak F J， CihalikovaJ， etal. Induction of tetraploid cymbidium plants from colchicines-treated protocorms Cultured in vitro ［J］. Plant Tissue Cell Culture，1984，455-456.

［3］ Hsien R M，Chen W H，Wu C C，et al.Artificial Induction of polyploidy in Doritis Pulcherrima［J］.Report of the Taiwan Sugar Research Institute，1991，132:13-18.

［4］ Kim Miseon， WonJeYang， SongChangHoon， etal.Polyploidy induction of Cymbidium Kanran by treatment of colchicine in vitro ［J］.Journal of Horticulture Science，1997，39(1):73-76.

［5］ 李雪娇，李枝林，黄丽萍.野生碧玉兰多倍体诱导及鉴定［J］.中国农学通报，2010，26(13):261-266.