烤烟组织培养中常见问题与应对措施

谢 强，何余勇，罗定棋，赵磊峰，张永辉，年夫照，谢云波

(1.四川省烟草公司泸州市公司 技术中心，四川 泸州 646000;2.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650203)

烟草常采用有性繁殖，但易发生变异，造成品质退化及多种病害发生，影响经济收入。组织培养可以保持烟草品种的优良性状，减少病虫害，从而达到高产优质的目的［1］。近年来，在烤烟及烤烟变异株的繁育上，组培技术发挥了积极作用。谢庆华等［2］从五种培养基中筛选出最佳配方，探索利用烤烟组织培养来提供市场所需的大量种苗;彭剑涛等［3］利用组织培养技术，筛选获得烟草抗性材料;谢丽琼等［4］则对植物组织培养常用培养基有机组分进行了失效分析。

虽然植物组织培养的操作过程并不复杂，但一些技术环节要求却十分严格，若出现一些技术细节失误，就会使试验无法进行下去，甚至导致整个试验的失败［5-6］。目前，关于烟草组织培养的报道已非常多，主要集中在组培外植体选择及植物激素配比等方面。本文根据烤烟组培过程中出现的问题，结合文献，对烤烟组培过程中常见问题与引发原因进行了分析，旨在为烤烟组培快繁提供一些参考依据。

1 烤烟组织培养研究现状

植物组织培养技术是依据植物细胞全能性及植物的再生作用，通过无菌操作分离植物体的一部分，接种到培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其产生完整植株的过程［7-8］。随着研究领域的不断拓展，植物组织培养技术从最初的无性繁殖逐步渗透到植物生理学、病理学、遗传学、育种学以及生物化学等各个领域，成为生物学科中重要研究技术和手段［9］。在植物脱毒及快速繁殖、单倍体育种、突变育种、体细胞杂交育种、工厂化育苗、药用植物开发与种子资源保存等方面具有重要的应用前景。

烤烟是我国烟草生产的重要组成部分，对于改善烟区经济和农村基础设施建设发挥着重要的作用。同时，烟草还是典型的基因工程模式植物［10］，在科学研究方面发挥着重要作用。近年来，人们在烟草的组织培养中已取得了很大的突破，相关报道层出不穷［2，11-12］，这为烟草的快速繁殖，产业化应用与推广等提供了有利的基础条件。

2 烤烟组织培养污染与控制

2.1 烤烟组织培养污染的原因

烤烟组织培养污染源包括内因污染和外因污染。内因污染指由于外植体的表面消毒或者内部带菌而引起的污染;外因污染则是由环境污染和操作不当引起，主要是在接种或培养过程中病菌入侵［8］。相比而言，内因污染比外因污染更难控制，特别是外植体内部带菌，表面消毒剂的作用效果不明显。

造成污染的病原主要为细菌、真菌和内源菌［6］，从微生物种类上可分为真菌污染和细菌污染，并常表现为复合污染。真菌污染表现为霉菌污染，是由于超净工作台等操作环境不清洁及操作不当等引起;细菌污染则表现为白色、透明色或有色的脓状物，常由于外植体带菌、灭菌不彻底或操作不慎造成;内源菌污染则可能表现出前两者的症状，常由于外植体材料内部的微生物 (真菌、细菌)不能被一般的表面消毒方法清除而引起 (图1)。

2.2 烤烟组织培养污染控制的措施

图1 烤烟组织培养过程中常见的污染现象

烤烟组织培养中污染产生的原因，应从外植体消毒和无菌操作两方面来改善。控制外植体自身带菌，可通过一系列消毒处理来减少或控制;至于内源菌污染的外植体，可通过外植体的预培养来控制;通过无菌操作来提供对无菌的环境条件。

2.2.1 外植体的消毒

尽量选用无菌的外植体材料，以减少外植体自身带菌的影响。利用一些消毒剂，如5%～10%的漂白粉、75%酒精、0.1%升汞、2%～10%次氯酸钠和10%过氧化氢等杀死外植体表面的各种微生物。根据不同材料选用不同的消毒剂及其适宜的浓度和处理时间，运用不同的消毒方法［13］。本研究采用10%过氧化氢作为消毒剂，8 min消毒时间能够取得很好的消毒效果;同时，在外植体消毒的最后环节，将消毒过的外植体在抗生素溶液中浸泡2～3 min，对于减少组培过程中的污染也具有良好的效果。

2.2.2 无菌操作与培养

操作人员要严格遵守无菌操作规程，减少或避免培养材料和培养基的污染。操作人员在进入接种室前，要换上消过毒的工作服、鞋帽和口罩［13］，并戴上无菌乳胶手套;操作前，超净工作台要用紫外灯杀菌8～10 min，操作人员要用75%酒精擦洗双手，操作中也要间歇性擦洗;每次操作结束之后，剪刀、镊子、手术刀等工具都要灼烧灭菌。

经过消毒后的外植体接种于培养基中进行无菌培养，要注意培养箱的无菌控制，打开培养箱要轻开轻闭，避免大的空气流通;另外，在培养基中加入适宜浓度的抗生素，如青霉素、链霉素、土霉素、头孢霉素等细菌、真菌抗生素，也能够较好地抑制杂菌的污染。

3 烤烟组织培养玻璃化与控制

3.1 玻璃化发生的原因

植物组织培养中，常可以见到一些半透明状的畸形试管苗，这类植物体被称为玻璃苗，这种现象被称为玻璃化现象［14］(图2)。

图2 烤烟组织培养过程中玻璃化现象

发生玻璃化的组培苗，其组织结构和生理功能异常，分化能力低下，玻璃化已成为组织培养工作中的一大难题。导致玻璃化的因素很多，不同植物玻璃化诱发因素往往不同，引起烤烟组织培养的玻璃化现象的原因可能有:在培养过程中的光照、温度、湿度和pH值等条件与适生环境差别较大;烤烟外植体部位、类型、素质等诱导玻璃苗的发生;培养基的成分如Ca，N，Mn，Fe，B，Zn含量低等。

3.2 减轻玻璃化的控制措施

减少烤烟组织培养过程中的玻璃化现象，可以通过合理选择外植体类型，优化、调控培养基配方，为不同阶段的培养物提供适宜的生长环境。一是合理选择烤烟组培外植体的类型。烤烟组培常用的外植体有茎段、茎尖、幼嫩叶片和根尖等，一般幼嫩叶片和茎尖组织可以减少玻璃化。二是适当利用固体培养基，增加培养基硬度。调节培养基的pH值，提高琼脂浓度，玻璃化的比例明显下降［15］。三是适当降低细胞分裂素的浓度，根据组培的不同阶段，合理调节细胞分裂素与生长素的比例。四是适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的水分。五是尽可能降低培养容器内的相对空气湿度和改善氧气供应状况，要注意薄膜的通透性或改用透气膜。

4 烤烟组织培养黄化与控制

黄化是指在组培过程中由于培养基成分、环境、激素、碳水化合物等各种因素引起的幼苗整株失绿，全部或部分叶片黄化、斑驳 (图3)。

引起烤烟组织培养过程中黄化的原因主要有:培养基中Fe的含量不足;各种矿质营养不均衡;培养环境通气不良，瓶内乙烯含量升高;激素配比不当;糖用量不足或长时间不转移致使糖已耗尽;pH值变化过大;培养温度不适;光照不足等［15］。

图3 烤烟组织培养过程中黄化现象

减少烤烟组织培养过程中黄化的关键，在于调节培养基中成分与含量，改善组培环境，主要有:在配制母液和培养基的制作过程中，对培养基的每一个化学成分都要认真细致地核对，称量的每一个环节务求精确;减少培养基消耗，及时转接培养物，避免因培养基营养不足导致组培苗黄化;选用通气良好组培瓶或罐，使用透气的封口膜，改善瓶内通气状况;适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度，减少抗生素的用量和频率;改善培养室内的温湿度环境，适当增加光照。

［1］ 肖军，张云霄，刘伯峰.烟草的组织培养技术研究 ［J］.泰山学院学报，2009(6):94-98.

［2］ 谢庆华，吴毅歆，桑林，等.烤烟‘K326’的组织培养与快速繁殖 ［J］.植物学通报，2005(1):50-53.

［3］ 彭剑涛，向结.利用组织培养技术获得烟草抗性材料的研究 ［J］.种子，2002(3):26-27，30.

［4］ 谢丽琼，常菊芹，宋祥春，等 植物组织培养培养基有机组分时效分析 ［J］.生物技术，2008(4):69-71.

［5］ 高华援，王楠，王庆峰，等.马铃薯组织培养中常见的污染问题及解决办法 ［J］.吉林农业科学，2007，32(2):28-30.

［6］ 朱小虎，王晓炜，米立刚.植物组织培养中存在的问题及改进方法 ［J］.新疆农业科学，2006，43(6):95-98.

［7］ 孙志强，孙占育.植物组织培养技术在生产上的应用与进展 ［J］.陕西农业科学，2010(3):98-100.

［8］ 王鲁彤.浅谈植物组织培养技术存在的问题与应用 ［J］.现代农业科学，2009(8):4-5.

［9］ 张东旭，周增产，卜云龙，等.植物组织培养技术应用研究进展 ［J］.北方园艺，2011(6):209-213.

［10］ 焦浈，秦广雍.烟草叶片愈伤组织诱导及真空耐受性研究［J］.郑州大学学报:理学版，2003，35(1):46-48.

［11］ 邹永梅，黄雪方.“烟草组织培养”的技术探讨 ［J］.江苏教育学院学报:自然科学版，2007(3):28-29.

［12］ 焦浈，秦广雍，等.烟草叶片愈伤组织诱导及真空耐受性研究 ［J］.郑州大学学报:理学版，2003，35(1):46-48.

［13］ 陈桂芳，娄利华.植物组织培养中几个常见的技术问题［J］.重庆林业科技，2003(4):50-51.

［14］ 黄海波，淡明，郭安平，等.植物组织培养中存在的主要问题与 对 策 ［J］.安 徽 农 业 科 学，2006，34(12):2632-2633.

［15］ 潘娟，李先源，李名杨.植物组织培养过程中常见问题及解决方法 ［J］.安徽农业科学，2009，37(6):2392-2394.