红托竹荪多糖抗氧化活性的研究

王蓓蓓，段玉峰，邵红军，田 甜，牛付阁，梁 蕾

陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安710062

红托竹荪(Dictyophora rubrovalvata)是1976年发表的新种，是由我国学者命名的。它是一种担子菌(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、腹菌纲(Gasteromycetes)、鬼笔目(Phallales)、鬼笔科(Phallaceae)、竹荪属(Dictyophora)，野生红托竹荪主要分布于中国贵州中(西)部、云南、四川和浙江等省区竹林下的腐殖土上。红托竹荪较高的营养价值，此外还含有极为丰富的矿物元素［1，2］。除其营养价值外，同时还具有一定的防病保健作用，长期服用竹荪具有治疗慢性气管炎、降低血压和减少血液中的胆固醇含量等功能。红托竹荪是竹荪中的珍品，具有很大的开发优势。多糖是红托竹荪子实体中重要组成成分之一。关于竹荪生物活性成分的研究最早见于日本人对长裙竹荪多糖抗肿瘤的研究，表明其具有抗肿瘤，提高免疫力的功能［3］。目前，对红托竹荪的研究主要集中于栽培条件［4］、多糖的提取工艺及其抗肿瘤［3］的研究。国内外对红托竹荪多糖的体外抗氧化活性研究较少［3，5］。

鉴于此，本论文主要以贵州织金县红托竹荪为研究对象，对其中多糖的抗氧化活性进行研究，从而为进一步开发利用红托竹荪提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

红托竹荪购于贵州织金县，由中国科学院昆明植物研究所副研究员于富强鉴定为红托竹荪(D.rubrovalvata)乙醇(75%)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、FeSO4·7H2O、DPPH自由基、H2O2、抗坏血酸(VC)、二丁基羟基甲苯(BHT，食品级); RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂); SHZ-III型循环真空泵(上海亚荣生化仪器厂); AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);HHW-21CU-600型电热恒温水槽(上海福玛实验设备有限公司);DGX-9073B-1电热鼓风干燥箱(上海福玛实验设备有限公司);Alphal-4型真空冷冻干燥机(德国Chris公司);WFJ2000型可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);T6新世纪紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);800B型离心机(上海安亭科学仪器厂)

2 方法

2.1 红托竹荪多糖粗提物的制备

称取烘干的红托竹荪15 g，过40目筛，用75%乙醇脱脂48 h，挥干乙醇，然后以水为提取溶剂，料液比1∶31，提取温度75℃，提取3.5 h，对提取液进行离心(3000 rpm)20 min，取上清液。将得到的粗提液减压浓缩至膏状，用少量蒸馏水溶解所得到的浓缩物，直至无色。然后将得到的浓缩物真空冷冻干燥24 h，得到竹荪多糖粗提物，备用。

总糖含量测定采用苯酚-硫酸法［6］。绘制标准曲线:准确称取标准葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，蒸馏水定容。精确称取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 mL，分别加入试管中，补水至2.0 mL，加入6%苯酚1.0 mL和浓硫酸5 mL，放置10 min后，摇匀，室温放置20 min，于490 nm处测定吸光度值，平均测定三次，取平均值，以2.0 mL蒸馏水同样操作作为空白，以葡萄糖浓度作为横坐标，吸光度值作为纵坐标，得葡萄糖标准曲线回归方程。

样品的测定，取一定浓度的样品溶液1.0 mL，补水至2.0 mL，其他操作同上，测定吸光度值，根据标准曲线计算多糖含量。

2.3 红托竹荪多糖总还原能力的测定

一般情况下，样品的还原能力与抗氧化活性之间有显著的相关性。样品反应后的生成物在700 nm处的吸光度的大小即反映了其抗氧化能力的大小，吸光度值越大，则样品的还原能力越强，红托竹荪多糖的还原力测定依照文献进行［7］。于1 mL不同浓度的红托竹荪多糖溶液中加入2.5 mL，0.2 mol/L，pH为6.6的磷酸盐缓冲液和2.5 mL，1%的铁氰化钾溶液，50℃水浴20 min，加入2.5 mL，10%的三氯乙酸(TCA)溶液，3000 rpm离心10 min，取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸馏水0.5 mL FeCl3(0.1%)，于700 nm处测定吸光值。以VC和BHT为对照，每组做3个重复，求其平均值。

2.4 红托竹荪多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

采用邻苯三酚自氧化法［8］，取pH为8.12的Tris-HCl缓冲液6.0 mL和蒸馏水0.5 mL，混匀，37℃水浴10 min，加入37℃预热过的7 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液(PR)1 mL，迅速摇匀，混匀后精确反应4 min，用0.5 mL浓盐酸终止反应，测325 nm处吸光度值A0。取pH为8.12的Tris-HCl缓冲液6 mL，分别加入不同质量浓度的竹荪多糖溶液0.5 mL，37℃水浴10 min，最后加入37℃预热过的7 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液(PR)1 mL，迅速摇匀，混匀后精确反应4 min，用0.5 mL浓盐酸终止反应，测325 nm处吸光度值A。以VC和BHT作为阳性对照，每组做3个重复，求其平均值。

计算公式如下:

2013年，水利系统迎难而上，在成功应对东北流域性大水、南方大范围干旱、沿海超强台风等方面做了大量工作，水利事业取得新进展，有力支撑了粮食“十连增”和经济社会发展。谨向全国广大水利干部职工表示诚挚问候！希望同志们认真落实党中央、国务院决策部署，围绕改革创新、转型升级和民生改善，集中力量建设一批重大关键性水利工程，夯实农田水利基础，增强防灾抗灾能力，严格水资源管理，为全面建成小康社会提供坚实的水安全保障。

2.5 红托竹荪多糖对羟基自由基的清除作用［9，10］

利用Smironff等的改进方法，在10 mL的试管中依次加6 mmol/L FeSO42 mL、2 mL不同浓度的竹荪多糖溶液或VC溶液、BHT溶液，以及6 mmol/L的 H2O2溶液2 mL，摇匀，静置 10 min，再加入6 mmol/L的水杨酸溶液2 mL，摇匀，静置30 min后，于510 nm处测定吸光值，以VC和BHT作为阳性对照，每组做3个重复，求其平均值。按以下公式计算各试样对羟基自由基(OH·)的清除率:

清除率(%)=A0-(AS-AX)/A0×100%

式中:A0—不加样品溶液的吸光值;AS—加入样品溶液反应后的吸光值;AX—不加水杨酸溶液时红托竹荪多糖的吸光值;

2.6 红托竹荪多糖对DPPH自由基的清除作用［7］

将红托竹荪多糖、VC和BHT分别配成等浓度(0.2～1.2 mg/mL)的溶液，吸取0.5 mL试样与0.5 mL水于试管中，混合均匀后，再加入DPPH·溶液充分摇匀，在室温下避光保存20 min，然后在517 nm处测定吸光值，并以VC和BHT作阳性对照，以95%乙醇调零，每个处理试样均做三个平行实验，按下式计算各试样对DPPH·自由基的清除率:

式中:A0—0.5 mL95%乙醇+0.5 mL水+2 mL DPPH·的吸光值;AS—0.5 mL试样+0.5 mL水+2 mL DPPH·的吸光值;AX—0.5 mL试样+ 0.5 mL水+2 mL95%乙醇的吸光值;

2.7 半数清除率(EC50)的测定

EC50指清除率为50%时所需样品的质量浓度。所需质量浓度越低，表明半清除率越高，清除效果越好［11］。将各项实测数据用拟合优化法来模拟S曲线，可通过Scatchard法和Hill法使量效关系S型曲线直线化［12］，并得出线性方程y=mx+c，从中即可计算出EC50值。

3 结果与分析

3.1 总糖含量

所测得结果做标准曲线:y=0.1061x+0.1566(R2=0.9902)，以葡萄糖浓度作为横坐标，吸光度值作为纵坐标。计算出提取物中总糖含量为80.9%.

3.2 总还原能力的测定

图1 红托竹荪多糖总还原能力的测定Fig.1 Reducing capacity of polysaccharides from D.rubrovalvata

由图4所示，红托竹荪多糖具有一定的还原能力，随着多糖质量浓度的增大，总还原能力随之增强。在所测定的浓度范围内，红托竹荪多糖的还原能力稍低于BHT的，但明显低于VC的。

3.3 对超氧阴离子自由基的清除作用

图2 红托竹荪多糖对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.2 Scavenging activities on O of polysaccharides from D.rubrovalvata

由图1所示，在样品浓度低于0.4 mg/mL时，红托竹荪多糖对超氧阴离子自由基的清除作用很小，但随着质量浓度的增大，清除率逐渐增大，最大可达到20%。当质量浓度大于0.6 mg/mL时，多糖的清除效果大于BHT的，但都小于VC的。

3.4 对羟基自由基的清除作用

由图2所示，红托竹荪多糖对OH·的有一定的清除作用，其清除率最大可达到59%，在所测定的浓度范围内，红托竹荪多糖对OH·的清除效果明显大于BHT的46.7%，但都明显小于VC的。

图3 红托竹荪多糖对羟基自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activities on OH· of polysaccharides from D.rubrovalvata

3.5 对DPPH自由基的清除作用［13］

图4 红托竹荪多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging activities on DPPH· of polysaccharides from D.rubrovalvata

由图3所示，在实验所测的浓度范围内，红托竹荪多糖对DPPH自由基有一定的清除效果，并随着样品质量浓度的增大，清除率逐渐增大，呈现一定的量效关系。并且红托竹荪多糖对DPPH自由基的清除效果大于BHT的，但小于VC的。

3.6 半数清除质量浓度(EC50)测定结果［14］

表1 多糖、BHT和VC的EC50值Table 1 The value of EC50on polysaccharides，BHT and VC

EC50值越低，表明清除率越高，清除效果越好。由表1可知，红托竹荪多糖清除O和DPPH·的EC50值明显小于BHT的，表明红托竹荪多糖有一定的抗氧化能力。

4 结论

本实验采用体外产生的活性自由基系统，通过测定样品中总多糖对自由基的清除作用，从而对红托竹荪的抗氧化能力进行研究。在所测定的浓度范围内，红托竹荪多糖对O-·2、OH·均有一定的清除作用，其清除效果与BHT的基本相当，但都明显低于VC的清除能力;对DPPH自由基有一定的清除作用，且略高于BHT的清除作用，但都低于VC。总体而言，红托竹荪多糖具有一定的抗氧化能力，为进一步的开发利用提供了理论依据。

1 Jiang SZ(姜守忠)，Lin CZ(林朝忠)，Wu Y(吴勇)，et al.Zhusun Zaipei yu Zhizhong Jishu(竹荪栽培与制种技术).Guiyang:Science and Technology Press of Guizhou，1991.68-82.

2 Wu Y(吴勇)，Jiang SZ(姜守忠)，Lin ZZ(林朝忠).Zhusun Zaipei yu Jiagong Jishu(竹荪栽培与加工技术).Guiyang:Science and Technology Press of Guizhou，1997.4-85.

3 Zhao K(赵凯)，Wang FJ(王飞娟)，Pan XB(潘薛波)，et al.Extraction and preliminary study of anti-tumor activity about amylose of Dictyophora rubrovalvata.Mycosystema(菌物学报)，2008，27:289-296.

4 Zhang JX(张建新)，Yu JY(余金楹)，Wang LJ(王黎瑾).Preliminary report on separated cultivation of mother Dictyophore Rubrovlata.J Zhejiang Forest Sci Technol(浙江林业科技)，2001，21，38-40.

5 Lian B(连宾)，Yu JP(郁建平).Study on the polysaccharides extraction from mushroom Dictyophora rubrovalvata by TLC.Food Sci(食品科学)，2004，25(3):43-45.

6 Zhang WJ(张维杰).Sugar complex biochemical research technology(糖复合物生化研究技术).Zhejiang University Press，2003.

7 Chow ST，Chao WW，Chung YC.Antioxidative activity and safety of 50%ethaolic red extract.J Food Sci，2003，68:21-25.

8 Wu Q(吴青)，Huang J(黄娟)，Luo LX(罗兰欣)，et al.Antioxidant activity of 15 kinds of herbal extract.J Chin Inst Food Sci Technol(中国食品学报)，2006，(6):281-289.

9Yang GM(杨方美)，Wang L(王林)，Hu QH(胡秋辉).Polysaccharide preparation and antioxidant activity about Jiangsu thunbergii.Food Sci(食品科学)，2005，26:224-228.

10 Jia ZD(贾之慎)，Wu JM(邬建敏)，Tang MC(唐孟成).Determination of hydroxyl radicals produced by Fenton reaction.Prog Biochem Biophys(生物化学与生物物理进展)，1996，23:184-186.

11 Dong CJ(董彩军)，Xie MY(谢明勇)，Nie SP(聂少平)，et al.Antioxidant activity about Cyclocarya Paliurus extracts.Food Sci(食品科学)，2007，28(10):31-34.

12 Liu CX(刘昌孝)，Sun RY(孙瑞元).Experimental design and statistical evaluation of drug.Beijing:Military Medical Science Press(军事医学科学出版社)，1999.31

13 Molyneux P.The use of the stable free radical di-phenylpicrylhydrazyl(DPPH)for estimating antioxidant activity.Songklanakarin J Sci Technol，2004，26:211-219.

14 Liu AQ(刘爱青).Extraction and biological activity about flavonoids of locusts.Xian:Shaanxi Normal University(陕西师范大学)，Master，2007.