骆驼蓬种子中一种具抗肿瘤活性蛋白的分离纯化及鉴定

马晓瑾，吴 婷，罗晶晶，王 燕，李 阳，刘东亮，孙素荣

新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046

脂转移蛋白(lipid transfer proteins，LTPs)是一类分子量相对较小的碱性蛋白质，在植物、动物、酵母、真菌和一些细菌中均有发现［1］。在植物中仅发现有非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer proteins，nsLTPs)。根据分子量的不同，植物脂转移蛋白可分为三类。第一类是nsLTPI，分子量大约为9 kDa;第二类是nsLTPII，分子量大约为7 kDa;另外，还有一些研究发现了一些分子量大于10 kDa的脂转移蛋白［2，3］。现已从多种植物中分离得到LTPs，如玉米［4］、水稻［5］、甜桔［6］、箩卜［7］、拟南芥［8］等。由于植物nsLTPs具有很强的抗真菌和细菌的活性，所以被列为植物防御蛋白系列。然而近年来一些研究还发现植物nsLTPs还具有较强的抗肿瘤活性，2007年Peng Lin［9］等人研究发现nsLTPs涉及细胞程序性死亡;芸苔属的脂转移蛋白(LTP)能抑制肝癌细胞Hep G2和乳腺癌MCF 7细胞的增殖; 2008年Linda S.M.Ooi［10］等人从水仙花中分离出的脂转移蛋白NTP能抑制急性前髓性白血病(HL-60)细胞的增殖。由于脂转移蛋白表现出的多种生物学活性，目前已引起很多学者的广泛关注。

本研究的实验材料为骆驼蓬(Peganum harmala)，是蒺藜科(Zygophyllaceae)骆驼蓬属(Peganum)的一种多年生草本植物，已列入维吾尔药卫生部药品标准［11］。目前的研究表明，骆驼蓬富含多种生物碱，具有抗癌、消炎和抗病毒等多种药理及杀虫抑菌活性［12-14］，但关于骆驼蓬活性蛋白的研究仅见于本课题组对其蛋白粗提物的活性研究［15］，骆驼蓬活性蛋白的分离纯化和活性的研究尚未见报道。因此，本文从骆驼蓬种子中分离纯化出抗肿瘤作用较强的脂转移蛋白并初步研究其抗肿瘤活性，可为进一步研究其抗肿瘤机制及抗肿瘤新药的研制开发提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

骆驼蓬种子采自乌鲁木齐红雁池水库。宫颈癌HeLa、食管癌Eca109、肝癌BEL-7404、胃癌MGC-7和非洲绿猴肾细胞Vero细胞购自中科院上海细胞库。CM阳离子交换层析柱，Superdex 75凝胶过滤层析柱购自GE公司，HPLC Columns购自Agilent公司。细胞培养基购自GIBCO公司，MTT购自SIGMA公司，Bradford蛋白检测试剂盒，其他试剂为国产分析纯。AKTA purifier蛋白纯化仪购自GE公司，电泳设备购自北京六一仪器厂，CHRIST冻干和CO2培养箱购自北京五洲东方科技公司，生物安全柜购自HEAL FORCE，荧光显微镜为LEICA CTR6000，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，高效液相层析仪购自日本Shima DZU公司。

1.2 方法

1.2.1 骆驼蓬蛋白的分离纯化

称取200 g干燥的骆驼蓬种子用粉碎机打成细粉，用预冷0.01 mol/L pH 7.2的PBS溶液2000 mL在4℃浸泡，磁力搅拌器搅拌12 h，5000 rpm，4℃离心15 min。上清液4层纱布过滤得棕色滤液，根据滤液体积加入硫酸铵调至饱和度为50%，去除蛋白沉淀，在澄清液中继续加硫酸铵调至饱和度为80%进行盐析。最后把沉淀分别溶于少量PBS，并移至透析袋中，以相同缓冲液为透析液在4℃下透析脱盐(每4～8 h左右换一次透析液)，直至用1%BaCl2检测硫酸铵已完全除尽。最后将蛋白粗提液冷冻干燥，得到一定量的蛋白粗品干粉。

用0.01 mol/L，pH5.0的PBS缓冲液平衡CMSepharose柱。骆驼蓬蛋白粗品溶解过滤后，上柱，流速为0.5 mL/min。平衡缓冲液洗去未吸附的蛋白和色素，分别用包含0.1，0.2和1M NaCl的PBS缓冲液进行分步洗脱，流速为1 mL/min。穿流峰和洗脱峰经抑癌活性检测，收集活性峰，保存于-20℃备用。活性峰样品经浓缩后上样于含0.15 mol/L NaCl的0.01 mol/L PBS(pH 7.2)预平衡的Superdex 75柱，流速为0.5 mL/min。收集活性峰，保存于-20℃备用。

1.2.2 分子量测定

将纯化的各组分进行Tricine-SDS-PAGE电泳检测其分子量［16］。考马斯亮蓝R-250的染色，脱色后用凝胶成像系统对电泳结果进行记录并分析。高效液相色谱(HPLC)对骆驼蓬纯化的蛋白组分进行纯度和表观分子量检测。柱型号为 TSK-G4000 PWxl，柱温25℃，测波长为280 nm，流动相为0.05 mol/L PBS(pH 7.2)，溶剂为 0.05 mol/L PBS (pH7.2)，进样量为20 μL，流速为0.8 mL/min。分别取下列标准品作标准曲线方程:乳铁蛋白71 kDa，卵清白蛋白44 kDa，碳酸酐酶29 kDa，β-乳球蛋白18 kDa，溶菌酶14 kDa。分析方法采用归一法［17］。

1.2.3 N-端氨基酸序列测定

将纯化蛋白进行Tricine-SDS-PAGE电泳，再转至PVDF膜上，经考马斯亮蓝R-250染色后切胶，采用EDMAN降解法完成N-端氨基酸序列测定。将序列结果在蛋白质数据库NCBI中作比对，进行同源序列分析。

1.2.4 增殖抑制活性检测

取对数生长期细胞，加到96孔板中，每孔加入100 μL，细胞密度为5×104个/孔。在5%CO2，37℃继续孵育12 h至细胞贴壁，将不同浓度的骆驼蓬蛋白用灭菌PBS溶解，过滤除菌，每孔加100 μL，设5个重复孔。5%CO2，37℃孵育不同时间后倒置显微镜下观察。弃去各孔液体，每孔加入20 μL 5 mg/ mL MTT溶液和80 μL培养基，继续培养4 h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择 490 nm波长处测量各孔的吸光值(OD490)。细胞生长抑制率(%)=(阴性对照组OD490－空白组 OD490)－(实验组 OD490－空白组OD490)/(阴性对照组 OD490－空白组 OD490)× 100%。根据药物浓度与抑制率的反应曲线，用作图法求出半数抑制浓度(IC50)［18，19］。

1.2.5 细胞凋亡形态观察［20］

取对数生长期HeLa细胞接种于6孔板中，过夜培养贴壁后，加入浓度为40 μg/mL的纯化的蛋白PhLTP，作用24 h后收集细胞，用PBS洗一次，离心1200 rpm×5 min，弃上清。以4%多聚甲醛1 mL加入各孔固定20 min，离心1200 rpm×5 min，弃上清，再加入1 mL Hoechst 33258染色液(终浓度为10 μg/mL)，37℃避光孵育30 min，PBS洗三次，将6孔板置于LEICA DMI6000B型倒置荧光显微镜下随机观察5个视野，放大倍数为200倍并拍照。

1.2.6 数据处理

各组实验数据测定均做3个平行实验，结果取其平均值。各组数据之间采用单因素方差分析，用t检验进行组间均数的比较，使用SPSS 13.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 骆驼蓬蛋白的分离纯化

骆驼蓬蛋白粗提液经硫酸铵沉淀获得80%饱和度下析出的蛋白，经透析除盐后用CM阳离子交换层析分离得到4个组分，其中Co为穿流峰，Cx1、Cx2和Cx3(图1)为不同盐离子浓度线性洗脱峰。用MTT法检测各分离组分(150 μg/mL)对HeLa细胞的抑制作用，选择活性最强的洗脱峰Cx2进行下一步分离纯化。洗脱峰Cx2经Superdex 75凝胶过滤层析再次分离后，得到2个分离组分，CX2S2(图2)为活性较强的组分。收集该活性组分即为骆驼蓬纯化蛋白PhLTP。从100 g骆驼蓬种子中经硫酸铵沉淀、CM阳离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化得到的PhLTP脂转移蛋白的得率为1.05及纯化倍数为95.38(表1)。

表1 骆驼蓬蛋白经不同纯化步骤获得的色谱成分的得率Table 1 Yields of chromatographic fractions obtained at different steps of purification of P.harmala protein

2.2 分子量测定

图3 Tricine-SDS-PAGE图谱Fig.3 Tricine-SDS-PAGE profile of PhLTP

图4 PhLTP的表观分子量测定Fig.4 Native molecular mass estimation of PhLTP

将上步纯化得到的骆驼蓬脂转移蛋白经Tricine-SDS-PAGE鉴定，PhLTP在7.5 kDa左右处有单一条带(图3)，采用高效液相层析(HPLC)检测蛋白表观分子量，按标准曲线方程计算PhLTP的分子量为14.8kDa(图4)。

2.3 N-端氨基酸序列分析

PhLTP的 N-端 20个氨基酸的序列为ITCPQVTQSLAPCVPYLISG。采用BLAST法在NCBI数据库进行比对，分析显示该序列与与多种植物的脂转移蛋白具有很高的同源性，其中与甜橙的N端序列同源性最高为75%，其次是大戟70%，油菜70%，欧洲板栗50%(表2)。因此，将该纯化蛋白命名为骆驼蓬脂转移蛋白(P.harmala lipid transfer proteins)。

表2 PhLTP与其他脂转移蛋白的N端氨基酸序列比较Table 1 N-terminal sequence of PhLTP with those of lipid transfer protein from other species

2.4 增殖抑制活性和诱导凋亡

不同浓度的PhLTP处理HeLa、Eca-109、MGC-9和BEL-7404细胞48 h后，计算其对几种癌细胞的抑制率。表3结果显示PhLTP对几种癌细胞具有明显的抗增殖的作用(P＜0.01)，并且呈剂量依赖性。相比Eca-109、MGC-9和BEL-7404细胞，该蛋白对HeLa细胞的抗增殖作用比较明显，作用48 h时，其IC50为45 μg/mL。PhLTP对正常细胞Vero的影响较小。进一步研究PhLTP对HeLa细胞作用不同时间和不同浓度的影响，结果表明PhLTP对其对HeLa细胞的抑制作用具有时间和浓度依赖性(图5)。

表3 PhLTP对五种细胞的增殖抑制Table 3 Inhibition of PhLTP towards five cell lines

荧光显微镜下观察PhLTP对HeLa细胞的作用，从图6可见阴性对照组的细胞平铺贴壁生长，细胞之间排列紧密，呈现不规则多角形;而PhLTP处理组细胞数量少，形态轮廓变得不清晰，细胞明显变圆，且皱缩变形，细胞间连接减少，细胞脱壁而至悬浮状态。荧光显微镜观察发现阴性对照组细胞核染色均匀，PhLTP处理组细胞核染色加深，核固缩，并有凋亡小体形成。说明PhLTP能够诱导HeLa细胞的凋亡。

3 讨论

目前，中药抗肿瘤有效成分越来越多地被开发出来，据不完全统计，占抗癌药的32.25%的是源于植物药的抗癌制剂［20］，相对于化疗药物，中药抗肿瘤具有安全、低毒、副作用小、遗传致突变率低［21］等优点。因此，从天然药用植物中寻找具有抗肿瘤作用的新药物，已成为抗肿瘤新药研究和开发的一条重要途径。本文从传统维药骆驼蓬种子中通过一系列生物化学方法筛选获得了一种具有较强抗肿瘤活性的蛋白PhLTP。经SDS-PAGE和HPLC检测，它由二个相同的亚基组成，表观分子量大约为14.8 kDa。通过 N末端前20个氨基酸序列测定及与GenBank登录的脂转移蛋白氨基酸序列进行比对，发现骆驼蓬蛋白与甜橙、大戟，油菜和欧洲板栗等的脂转移蛋白具有较高的相似性，说明该蛋白是一种新的脂转移蛋白。本发现可为PhLTP基因的克隆提供一定的条件，为将来进一步将其研究开发成抗癌新药或在农业上研制转基因植物奠定基础。

图6 显微镜观察PhLTP诱导HeLa细胞凋亡的形态学变化Fig.6 PhLTP-induced morphologic changes in HeLa cells observed by microscopy

本实验纯化的PhLTP具有一定的抗肿瘤活性，MTT实验结果表明，PhLTP对多种癌细胞均具有抑制细胞增殖的作用，然而对正常细胞Vero的毒性较小，明显低于其对肿瘤细胞的抑制率(P＜0.01)。说明其对正常细胞Vero的影响较小，细胞毒作用较低，初步体现其毒副作用小的药用价值。

近年来，对脂转移蛋白的抗癌活性的研究越来越多，例如从红刺露兜树［22］，芥蓝［23］和水仙［10］等植物中得到的LTP都表现出抑制癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。本研究结果证实PhLTP能诱导HeLa细胞产生凋亡小体，对HeLa细胞具有明显的增殖抑制作用，而且具时间和浓度依赖性。目前的研究结果表明，凋亡诱导途径主要包括以Caspase-8激活为代表的死亡受体途径和以Caspase-9激活为代表的线粒体途径［24］，但有关脂转移蛋白的抗肿瘤活性的分子机制以及抗肿瘤与转脂功能之间的关系尚不清楚。因此，下一步我们将对PhLLTP的诱导凋亡机制进行深入的研究，这将对促进脂转移蛋白相关的生物学功能的研究和进一步开发利用具有重要意义。

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