蓝莓提取物对副溶血性弧菌的抑制作用

谢庆超，孙晓红*，沈 潇，Vivian C.H.Wu，潘迎捷

1上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306; 2美国缅因大学食品科学与人类营养系，缅因04469

副溶血性弧菌(又称嗜盐菌，Vibrio parahaemolyticus)作为常见的食源性致病菌之一，广泛地分布于虾、蟹等海产品中，人们食用经副溶血性弧菌污染的海产品后易产生腹泻等肠胃疾病。以2007年上海市肠道疾病调查为例，由食源性致病菌导致的肠道疾病占总肠道疾病的12.82%，其中副溶血性弧菌引发的疾病占76.92%［1］。曹慧慧等［2］对国内8个沿海城市大型水产品批发市场零售的贝类产品检测发现，62.67%的样品呈tlh阳性，即存在副溶血性弧菌污染。由于副溶血性弧菌多存在于海水中，进入海产品后很难被清除，人们又喜爱食用生或者半生的海产品，因此明显加剧了感染副溶血性弧菌的风险。

目前常用的水产品保鲜剂如山梨酸钾等化学保鲜剂由于其安全卫生问题引起人们的担忧，因此，具有抑菌功能的天然活性物质开始受到人们的重视［3-5］。蓝莓，又称越橘，不仅具有良好的营养保健作用，还具有防止脑神经衰老［6］、增强心脏功能、明目及抗癌等独特功效，因此被国际粮农组织列为人类五大健康水果之一。目前国内外对蓝莓活性物质研究集中在花青素［7］的分离提取和对人体功能、消化吸收及体内代谢等方面，对蓝莓的抑菌活性研究少有报道。目前已见报道的研究仅有:Ofek等［8］研究发现蓝莓汁可破坏大肠杆菌细胞膜，造成菌体受损死亡。QIU等［9］用蓝莓提取液处理汉堡中的牛肉能显著延长汉堡的货架期，且其感官品质未明显变化。陈玉峰等［10］研究发现，蓝莓果实中的花色苷对大肠杆菌有一定的抑制作用。然而，蓝莓对副溶血性弧菌的抑制作用尚未见报道。基于此，本文优化了蓝莓抑菌活性物质的提取工艺，并对副溶血性弧菌的抑菌效果进行研究，为蓝莓天然生物保鲜剂的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)品种为高丛蓝莓(High bush blueberry)埃利奥特(Alliot)，购自沃林(Wallin)农业青岛有限公司，保存于-20℃冰箱。

副溶血性弧菌ATCC33847购自于美国ATCC菌种保藏中心。

1.1.2 试剂

无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，TSB (3%NaCl)培养基与TCBS培养基(北京陆桥技术有限责任公司)。

1.1.3 主要仪器

8010s匀浆机(Waring Commerial)，pl2002电子天平(Mettler Toledo)，SK5200HP超声波清洗机(上海科导超声波仪器有限公司)，GG17旋转蒸发仪(SENCO)，QB9006微孔板快速振荡器(金坛市医疗仪器厂)，3799 96孔板(Corning Incorporated)。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

称取蓝莓5 g→快速解冻→匀浆→超声波提取→离心→布氏漏斗过滤→0.22 μm滤膜过滤→旋转蒸发浓缩至5 mL(其浓度即为1 g/mL)放于-20℃备用。

由于进行的是抑菌效果的验证，因此未考虑增加提取次数以提高得率。

1.2.2 超声波法提取蓝莓有效成分正交试验［11］

进行三因素四水平正交试验，按正交表L16(43)对乙醇浓度、提取温度、提取时间进行研究，每个因子4个水平，每个处理3次重复，具体见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Design of orthogonal experiment

1.2.3 蓝莓提取物pH值测定

采用pH计测定16种提取方法得到的蓝莓提取物的pH值。

1.2.4 副溶血性弧菌菌液制备

取斜面保藏的菌株，用TSB(3%NaCl)培养基活化两次。取1 μL菌液加入到10 mL TSB(3% NaCl)培养基中进行稀释，使菌液浓度达到 104CFU/mL。

1.2.5 蓝莓提取物对副溶血性弧菌抑制实验［12］

每个处理各取100 μL浓度分别为100和40 mg/mL的蓝莓提取液(1 g/mL原液经无菌水稀释)加入到96孔板两个孔中，再各取100 μL稀释后的菌液与蓝莓提取液混合，30℃振荡培养24 h。每个孔各取100 μL混合液涂布于TCBS培养基上，37℃培养24 h，计算每毫升菌落数。阳性对照采用100 μL山梨酸钾(0.5 g/kg)与菌液混合，空白对照采用无菌水代替蓝莓提取液与菌液混合(等同于阴性对照)。每个处理两个平行，实验重复3次。

1.2.6 数据处理

实验数据均采用三次平行实验的平均值，数据用Excel软件处理，数据间的差异通过统计软件SPSS13.0进行单因变量多因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同提取条件下蓝莓提取物抑菌正交试验结果

2.1.1 16种蓝莓提取物抑菌效果

采用不同条件提取获得的100和40 mg/mL的蓝莓提取液对副溶血性弧菌的抑菌效果如表2所示，当蓝莓提取物浓度为100 mg/mL时，处理组合A1B2C2、A1B4C4、A2B1C2、A2B2C3、A3B1C3、A3B2C4、A3B3C1和A3B4C2的抑菌率为100%，无法进行组内的有效比较。因此以40 mg/mL蓝莓提取物的抑菌率为考察指标，综合各因素K值结果，得出理论上最优条件为A4B3C1。影响蓝莓抑菌效果的因素排序为:C＞B＞A，即提取温度＞超声波时间＞乙醇质量分数。

2.1.2 不同因素对蓝莓提取物抑菌效果影响的比较

以抑菌率作为因变量，采用SPSS13.0对蓝莓提取物浓度为40 mg/mL的实验结果进行单因变量多因素方差分析，同时使用F检验对比三次重复，结果表明重复间差异不显著。从表3可以看出，C因素(温度)间差异显著(p=0.024)，说明不同的提取温度对蓝莓提取物抑菌效果影响最大，B因素(时间)间差异显著(p=0.069)，说明不同提取时间蓝莓提取物抑菌效果影响比较大，A因素(乙醇质量分数)间差异不显著(p=0.710)，蓝莓提取物抑菌效果影响不大，分析结果与正交试验结果一致。B因素和C因素各水平间均达到差异显著，说明提取温度和时间的不同对蓝莓抑菌活性有显著的差异，需进行区组内的多重比较。

表2 16种提取方法所得蓝莓提取物的24 h抑菌率Table 2 Inhibitory rate after 24 h under the 16 extract methods of blueberry

表3 抑菌效果的方差分析Table 3 Analysis of variance with the results of 24h inhibitory effects

2.1.3 最优提取条件的获得

以抑菌率作为评估标准，采用SPSS13.0进行各因素内不同水平的多重比较。图1中显示的是各因素内估计边际均值的比较，可以比较各水平的边际均数。由于实验中是以抑菌率作为因变量，因此均值越高则表明抑菌效果越好。由图1可以看出，A3、B3、C1在各自因素内有最好的抑菌效果，因此最优组合为A3B3C1，即采用质量分数为65%的乙醇溶液作为提取剂，超声波提取25 min，提取温度为30℃所得到的蓝莓提取物抑菌效果最佳。为比较正交试验获得的最优组合与SPSS13.0分析获得的最优组合，按照两种提取方法重复提取3次，测得A4B3C1的抑菌率为78.2%，A3B3C1为81.3%，表明乙醇浓度65%，超声波提取时间25 min，提取温度30℃是最优的提取条件。

图1 24 h抑菌效果的多重比较结果Fig.1 Multiple comparisons with the results of inhibitory rate

2.2 不同提取条件下蓝莓提取物pH值

通过比较16组蓝莓提取物的pH值可以看出，第11组pH值最低，仅为2.764，第3组pH值最高，达到了2.984。针对pH值较低的问题，又添加一组与最低pH值相同的HCl溶液作为处理液处理同样菌数的副溶血性弧菌，结果发现处理24 h后，菌数高达7.11 log CFU/mL，将提取物pH值回调至7，再次研究其抑菌效果，发现提取物无抑菌效果，说明蓝莓提取物的抑菌活性与提取物中的酸性物质没有直接关系。但本实验得到的抑菌最优组合同时具有相对较低的pH值，可能蓝莓中的活性物质要在低pH值下才能发挥最好的抑菌效果。

图2 16种提取方法所得蓝莓提取物的pH值测定结果Fig.2 pH determination under the 16 extraction methods of China Blueberry

3 讨论及结论

孟凡丽［13］、杨桂霞［14］和柳嘉［15］分别提取并鉴定了蓝莓果中花色苷、黄酮及多酚类物质。其中，花色苷是蓝莓提取物的主要着色成分，在较低的pH下花色苷才有较高的稳定性。本研究中我们也推测提取物中可能包含有一些酚酸类物质。在今后的实验中可以对提取物进行分离纯化，鉴定其主要成分，并研究各成分的抑菌功能。

近年来我国发生的食品安全事件层出不穷，透过这些事件，消费者对食品加工过程中使用的防腐保鲜手段感到极大恐惧。因此，如何让人们食用安全健康的食品是我国广大食品生产厂家以及科研工作者认真面对的问题。基于天然活性物质而开发新的防腐保鲜手段是最优也是最合理的解决方法。对于水产品，也有人研究了一些生物保鲜手段用以取代传统的化学保鲜方法。Fan［16］等人的研究表明在-3℃条件下喷淋0.2%的茶多酚能有效延长白鲢鱼的保鲜期，但是茶多酚很容易被氧化而且脂溶性不很理想，因此限制了其发展。王秀娟［17］等人研究了壳聚糖涂膜对虾的保鲜作用，发现保质期比未涂抹的虾延长了2～3 d，但壳聚糖保鲜膜效率低、难干燥、制膜强度差，且壳聚糖本身的涩味也降低了其使用率。本研究中得到的蓝莓提取物可以有效抑制副溶血性弧菌的生长，脂溶性好，本身具有清香，能改善口味，同时还具有抗氧化抗衰老等营养功能，缺点则是需要较低的pH值环境。

本研究以北高丛蓝莓中的栽培品种埃利奥特为材料，利用三因素四水平正交实验提取抑菌活性物质，最终确定最优提取条件是65%的乙醇(w/w)作为提取剂、温度为30℃，超声波时间为25 min。影响蓝莓抑菌效果的因素排序为:提取温度＞超声波时间＞乙醇质量分数。本研究为进一步研究蓝莓提取物对真实样品的抑菌效果及对副溶血性弧菌的抑菌机理研究提供了依据。

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