GPC3特异的siRNA筛选和对肝癌细胞增殖能力的影响

2012-12-20 11:34邱志东缪辉来雷长江刘忠考包仕廷
中国医药科学 2012年16期
关键词:肌醇孵育定量

邱志东 缪辉来 雷长江 刘忠考 黎 然 包仕廷

广东医学院附属医院肝胆外科,广东湛江 524001

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)被发现常在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中高表达,在HCC的发生发展中具有重要作用[1-2]。RNA干扰(RNA interference,RNAi)目前是一种成熟的研究基因功能的方法[3],本研究先设计特异靶向GPC3的siRNAs,然后进行筛选,并进一步验证有效抑制GPC3表达后对肝癌细胞增殖能力的影响,以此探讨GPC3在HCC中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肝癌细胞Huh7(南方医科大学病理研究所),DMEM、lipofectamine 2000和Trizol(Invitrogen),RT-PCR试剂盒(TaKaRa),SYBR Green PCR Master Mix(Toyobo),GPC3一抗和二抗(Novus Biologicals)。

1.2 细胞培养

Huh7细胞培养于含10%胎牛血清和双抗的高糖DMEM中,置于37℃、含5% CO2的细胞培养箱内培养,用0.25%的胰酶进行消化、传代。

1.3 siRNA设计合成

根据GPC3(Genbank号:NM_001164617)的序列,运用在线设计工具siSearch和sFold设计合成靶向GPC3的siRNA,并交由上海吉玛制药技术有限公司合成,序列如下:

表1 siRNA序列

1.4 siRNA转染

转染前1天,细胞接种6孔板,接种浓度为1×105个细胞/mL,每孔1 mL;第2天当细胞汇合度达到70%左右时进行转染,步骤参考说明书进行,siRNA终浓度设3个梯度为25 nmol(/L·孔)、50 nmol(/L·孔)、75 nmol(/L·孔);4~6 h后,更换完全培养基,72 h后进行后续检测。

1.5 荧光定量PCR检测

收集细胞,加入1 mL Trizol提取总RNA,定量后用1μg RNA进行逆转录,SYBR-Green染料法进行定量PCR,20μL体系含100 ng cDNA。反应条件为:95℃ 5 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,40 cycles。每个样做 3个重复,定量分析通过比较 2-ΔΔCt值进行。GPC3 和内参 GAPDH 定量所用引 物 为:GPC3-F:5'-AGAAACCTTATCCAGCCGAAGAA-3’;GPC3-R:5'-TGGGTCCAACTACTAAGCT-3’。GAPDH-F:5'-GGTATCGTGGAAGGACTC-3’;GAPDH-R:5'-GTAGAGGCAGGGATGATG-3’。

1.6 Western Blot

细胞收集后用PBS洗涤2次,加入含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer(1X PBS,1% NP-40,0.1% SDS,5 mmol/L EDTA,0.5%脱氧胆酸钠和1 mmol/L正钒酸钠)裂解细胞。蛋白样品定量后,于8% SDS-PAGE上进行分离,并电转至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉溶液进行封闭。加入稀释到合适浓度的GPC3和GAPDH一抗,于4℃孵育过夜进行免疫杂交。然后加入HRP标记的抗兔二抗,最后加入West Femto化学发光检测底物(PIERCE)进行反应,显影检测。

1.7 细胞增殖检测

培养细胞到汇合度达80%左右时,按EdU Apollo DNA in vitro Kit(锐博)说明书每孔加入100 μL含50μmol/L EdU培养基孵育2 h;弃培养液,每孔加入100 μL细胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育15~30 min,再加入2 mg/mL甘氨酸孵育10 min;PBS冲洗,每孔加入100 μL渗透剂(含0.5%TritonX-100的PBS)透化细胞;加入100 μL的1X Apollo染色反应液,避光、室温孵育30 min;加入100 μL 1X Hoechst 33342反应液,避光、室温孵育10~30 min;洗脱Hoechst33342反应液,荧光显微镜观察。

1.8 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件分析,计量资料以均数±标准差(± s)表示。荧光定量PCR和免疫蛋白印迹检测实验采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组间差异,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 特异靶向GPC3的siRNA筛选

不同浓度的siRNA转染细胞后,荧光定量PCR检测结果显示,当siRNA GPC3-homo-1633使用量为50 nm时沉默效率最高,为74.87%,而其他浓度和siRNA抑制效果均不超过70%(图1),因此后续实验选择GPC3-homo-1633进行。

图1 Real-time PCR检测靶向GPC3的siRNA的抑制效果

2.2 靶向GPC3的siRNA对GPC3蛋白水平的影响

用Western Blot检测GPC3-siRNA-1633对GPC3表达的影响,结果表明:在Huh7细胞中GPC3的表达能明显被抑制(图2)。因此,在Huh7细胞中,GPC3-homo-1633能特异靶向GPC3,导致GPC3转录翻译下调。

图2 Western Blot检测siRNA GPC3-homo-1633对GPC3表达的抑制效果,内参为GAPDH

2.3 GPC3表达下调会抑制Huh7细胞增殖

利用特异siRNA下调GPC3表达后,发现EdU阳性的Huh7细胞显著减少(图3),这说明GPC3表达沉默能抑制Huh7细胞增殖。

图3 siRNA下调GPC3表达后Huh7细胞增殖检测

3 讨论

全球原发性肝癌的发病率大约占所有肿瘤发病率的6%,其中有一半以上发生在中国[4],且其死亡率在恶性肿瘤中排第3 位[5]。越来越多的研究表明GPC3对于HCC,特别是对于AFP阴性的HCC,可能是一种新的、高灵敏性和特异性的HCC标志物[6-9]。

本研究成功筛选出能特异靶向GPC3的siRNA,可以显著抑制GPC3的转录翻译。而当GPC3表达下调后,发现Huh7细胞的增殖受到抑制。因此,可认为在HCC中GPC3具有癌基因作用,该基因的表达能够促进HCC的增殖能力。这与Sun等[10]的研究结果一致,他们通过转染GPC3特异的siRNA后,也发现HCC的生长受到抑制,且出现G1期细胞周期滞留。而Ruan等[11]通过转染靶向GPC3的shRNA表达载体下调GPC3表达后,发现MHCC97-H细胞的增殖和侵袭能力均明显被抑制。

本研究结果证明GPC3通过影响细胞的增殖而对HCC的生长起促进作用,但GPC3对HCC的影响作用其具体机制目前还没有研究清楚,有可能通过多种信号通路起作用。因此,还需要进一步研究GPC3在HCC中的具体作用,为HCC的防治提供理论基础。

[1] 罗飞兵,张焜和.Glypican-3与原发性肝癌关系研究进展[J].世界华人消化杂志,2010,18(2):155-159.

[2] Liu H,Li P,Zhai Y,et al.Diagnostic value of glypican-3 in serum and liver for primary hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2010,16(35):4410-4415.

[3] 张定校,樊斌,刘榜,等.RNA干涉(RNAi)技术应用于哺乳动物细胞的研究策略 [J].遗传,2005,27(5):839-844.

[4] Marrero JA.Hepatocellular carcinoma[J].Curr Opin Gastroenterol,2006,22(3):248-253.

[5] Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[6] 郭洪生,杜智,高英堂,等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 在肝细胞肝癌中的表达及意义 [J].中国肿瘤临床,2009,36(8):213-217.

[7] 金荣华,李莉,陈德喜.GPC3在肝癌早期诊断及发病机制中的意义[J].医学研究杂志,2011,40(4):3-5.

[8] 宋孟锜,杨永飞,王冬冬,等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和甲胎蛋白联合检测对原发性肝癌的诊断价值[J].临床肝胆病杂志,2011,27(4):391-393,399.

[9] 缪辉来,邱志东,温继育,等.肝细胞癌组织中Glypican-3基因表达及其调控机制[J].中国病理生理杂志,2008,24(9):1730-1733.

[10] Sun CK,Chua MS,He J,et al.Suppression of glypican 3 inhibits growth of hepatocellular carcinoma cells through up-regulation of TGF-β2[J].Neoplasia,2011,13(8):735-747.

[11] Ruan J,Liu F,Chen X,et al.Inhibition of glypican-3 expression via RNA interference influences the growth and invasive ability of the MHCC97-H human hepatocellular carcinoma cell line[J].Int J Mol Med,2011,28(4):497-503.

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