荧光定量PCR方法检测脑脊液中结核分枝杆菌DNA的意义

崔中锋 史继静

河南省传染病医院 郑州 450000

本文应用荧光定量PCR 方法与抗酸染色、改良罗氏培养法进行比较，以评价荧光定量PCR 在结核分枝杆菌检测中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源 河南省传染病医院2010-2011-08的住院病人。结核性脑膜炎组：根据病人临床症状、体征、脑脊液的常规及生化（参照结核性脑膜炎的诊断标准）［1］、头颅CT 等诊断为结脑，并经抗结核病治疗有效者136例。其中儿童64例，男性48 例，女 性16 例。年 龄3 个 月～14 岁，平 均4.5岁；成人72例，男性30例，女性42例，年龄15～75岁，平均35.8岁。非结核性脑膜炎组（以下简称非结脑组）：64例。

1.2 主要仪器及试剂 抗酸染色采用贝索热染法染色液，改良罗氏培养采用BD 9600仪器，实时荧光定量PCR 扩增仪器采用德国罗氏公司Light icycler 480；荧光定量PCR 方法检测TB-DNA 试剂购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.3 方法 采用荧光定量PCR 方法检测结核性脑膜炎组和非结核性脑膜炎组的脑脊液中TB-DNA，按试剂盒要求取5.0×103拷贝／mL 为临界值。结脑组同时进行抗酸染色及改良罗氏培养方法检测结核杆菌。

2 结果

结脑组和非结脑组应用荧光定量PCR 方法、抗酸染色、改良罗氏培养检测脑脊液中结核杆菌阳性率分别为59.56%、3.68%和7.8%。见表1。

表1 2组脑脊液标本检验阳性结果

为进一步证明荧光定量PCR 方法检测脑液中结核杆菌对结脑诊断的优势，对一部分病例间隔一段时间后，再次检测1～2次。检验有1次为阳性即做为阳性患者。经荧光定量PCR 方法检测结脑组不同次数的结果，分别为一次阳性率60.3%，2次阳性率85.4%，3次阳性率87.5%；第1次检测值最大6.3×106拷贝／mL，最小4.1×102拷贝／mL，平均5.34×104拷贝／mL，经抗结核治疗3周病情好转；第2次检测值最大8.1×105拷贝／mL，最小6.1×102拷／mL，平均为3.15×103拷贝／mL。这表明采用实时荧光定量PCR 方法检测TB-DNA，通过定量值的变化，能够做结核杆菌病原菌感染的早期诊断依据，还可观察疗效。

3 讨论

结脑是结核分枝杆菌引起的以脑膜炎为主的非化脓性炎症，是最常见的严重肺外结核病。由于结脑患者的脑脊液做结核杆菌抗酸染色和改良罗氏培养阳性率较低，因而给临床结脑的病原菌诊断带来很大困难。因此，应用荧光定量PCR 方法检测脑脊液中结核菌是较为理想的方法［2］，对结核性脑膜炎的诊断有决定性意义。我院采用PCR 荧光定量方法检测脑脊液结核杆菌的阳性率为59.56%，与廖锦良等［3］报道的57.3%与报道的53.5%、冯恩航等报道的57.4%较接近［4］。我院对同例应用荧光定量PCR 方法检测2次阳性率可达到85.4%，检测3次阳性率可达到87.5%，可见增加检测次数可增加脑脊液中结核分枝杆菌的检出阳性率；而应用荧光定量PCR 方法检测非结脑组脑脊液结核杆菌的阳性率为0，说明该方法具有很好的特异性。因而，应用PCR 荧光定量检测结果可比较准确地指示患者脑脊液中结核杆菌的多寡，不但有较高的阳性率，而且还具有很好的特异性和敏感性，对结核性脑膜炎不但可做病原菌诊断依据，而且还有助于指导患者临床用药和进行疗效评估，对临床具有很好指导意义。因此，当患者有结核性脑膜炎的临床表现，如发热、颅内感染症时，早期、多次的进行脑脊液TB-DNA 的定量检测是必须的。

［1］彭卫生，王英年，肖成志.新编结核病学［M］／／孔凡元.神经系统结核病.北京：中国医药科技出版社，1994：203-216.

［2］Tang YW，Procop GW，Persing DH.Molecular diagnostics of infectious diseases［J］.Clin Chem，1997，43（18）：2 021-2 038.

［3］廖锦良，谭耀驹，陈志成，等.Amplisensor-聚合酶反应定量检测脑脊液中结核分枝杆茵DNA 的研究［J］.中国防痨杂志，2001，23（4）：245-247.

［4］冯恩航，王冬梅，杨文碧，等.荧光定量PCR 方法检测脑脊液中结核茵DNA 的临床意义［J］，黑龙江医学，2011，35（4）：281-282.