IL-13基因多态性位点rs20541和rs1800925单核苷酸多态性与儿童支气管哮喘关联性的研究

舒 磊 杭州市红十字会医院 杭州 310003

支气管哮喘（asthma）是儿童最常见的呼吸系统变态反应性疾病，是由嗜酸粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的气道急、慢性疾病，多为过敏性炎症。2003年中国大陆13～14岁儿童中自觉有喘息症状的患病率大约为4%[1]。呼吸道的急性炎症可使气道管壁血管通透性增加、黏液分泌增多、平滑肌痉挛；而慢性炎症可进一步改变气道结构和功能，致使气道高反应性，引起喘息、咳嗽和呼吸困难等症状[2]。全世界早已达成共识，哮喘是由遗传、环境以及其他因素共同作用而引起的一种多基因、复杂性遗传病，并表现出强烈的遗传异质性和表型异质性[3]。迄今，科学家们已运用了各种方法，包括家系连锁关联分析、全基因组微卫星连锁分析、全基因组单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）扫描、综合分析（meta-analysis）等，以求揭示哮喘的遗传学基础。截止目前，全世界已经发现了100多个基因可能与哮喘的发生相关，所涉及的染色体区域包括 2p16、2p25、2q33、5q31-q33、7p14-p15、7q21、11q12-q13、12q24、14q24、19p13、20p12、20p13和20q13等[3]。我们研究了在哮喘发病中具有重要作用的IL-13基因的2个SNP位点：位于第4外显子编码区的rs20541和位于基因转录启动子区域的rs1800925的基因型频率分布特点及其多态性与儿童哮喘发病的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本组哮喘患者105例，男65例，女40例，年龄4～15岁，平均9.5岁；所有患者均符合中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》中的诊断标准，并仔细询问既往史、家族过敏史。其中具有家族史38例（男21例，女17例）。同时以近2周内无呼吸道感染症状，本人及三代以内的直系亲属无过敏史且既往无哮喘及反复呼吸道感染病史的112名健康汉族儿童为对照组，男58名，女54名，年龄4～16岁，平均8.3岁。

1.2 方 法 样本DNA提取 ①一次性抽取外周血5mL，以EDTA抗凝，用TIANamp Blood DNA Kit（北京天根生物工程公司）常规提纯基因组DNA。②用全基因组DNA分别扩增含有rs20541和rs1800925两个位点的DNA片段。PCR引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

PCR反应体系总体积50μL，其中包括引物各15pmol，1U Taq DNA 聚合酶，2.5mmol/LMgCl2，200 mmol/L dNTP和模板DNA 0.5μg。PCR反应条件：预变性95℃ lmin，95℃ lmin，60℃ 1min，72℃ lmin，共30个循环；延伸72℃5min（扩增仪为GeneAmp PCR System 9700）。③rs20541的扩增片段经纯化后在ABIPRISM 3100型DNA全自动测序仪上进行直接测序分析（由大上海生工生物工程技术服务有限公司完成）。以AS-PCR法分析SNP rs1800925。并随机抽取部分样本进行DNA直接测序，以保证基因分型结果的准确。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.0进行统计分析，计数资料的组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 rs20541基因型与哮喘发病的关联性 经χ2检验，哮喘组和正常对照组的IL-13 Arg130Gln（rs20541）基因型和等位基因的频率分布差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.2 rs1800925基因型与哮喘的关联性 经χ2检验，哮喘组和正常对照组的IL-13C-1111T（rs1800925）基因型和等位基因的频率分布差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表2 两组IL-13基因rs20541位点的等位基因频率分布 例（%）

表3 两组IL-13基因rs1800925位点的等位基因频率分布 例（%）

3 讨论

白细胞介素-13基因是（interleukin13，IL-13）位于人类染色体5q31，全长9937 bp，含有4个外显子，转录片段长1283 bp，编码含146个氨基酸残基的IL-13细胞因子[4]。IL-13基因为细胞因子基因家族成员，与IL-3、IL-5、IL-4以及CSF2簇集位于5q上。这些基因的结构相似，在5q23-q31区域上的排布顺序 为 ：cen-IL-3-CSF2-IL-13-IL-4- IL-5--tel。IL-13促使CD23在B细胞上表达，增强CD72和MHC II抗原的表达，促进IgE重链基因在B细胞上转录[5]。Zhu等[6]的研究表明，IL-13与酸性哺乳动物几丁质酶（acidicmammalian chitinase）介导的通路，在哮喘动物模型和哮喘患者的组织中表现出强烈的相关性。已经完成的多项研究显示，哮喘患者的气道中存在IL-13分子，IL-13可介导哮喘的多个主要特征（包括气道的高反应性、黏膜上皮化生、气道成纤维细胞的活化和增殖等），故IL-13基因与哮喘的诊断和治疗息息相关。

IL-13基因上存在不少的SNP位点，在哮喘患者中呈现强烈的连锁不平衡，如位于第3内含子中的+1923C→T，位 于 第 4外 显 子 中 的 +2044G→A（rs20541），位于3'非翻译区的+2525G→A、+2580C→A 和+2749C→T，位 于 启 动 子 中 的-1512A→C（rs1881457）和-1112C→T（rs1800925）等[5]。相关研究发现，IL-13的SNP 位点+2044G→A（rs20541）分别与血清IgE水平升高、嗜酸粒细胞增多、哮喘、过敏性皮炎和变应原皮试阳性等呈正相关[7]，而SNP位点-1112C→T（rs1800925）则分别与哮喘、气道高反应性和变应原皮试阳性、IgE水平、食物过敏等相关联[8]。

近5年来，全世界对哮喘与IL-13基因型相关性研究较多。Wu等[9]对252名中国中部地区哮喘患儿进行基因分型后发现，rs20541这个SNP位点表现出强烈的哮喘相关性，+2044A这种基因型为哮喘的遗传相关性。在亚洲地区，香港、日本、韩国等地区的学者分别对300名以上哮喘患儿进行基因分型，发现+2044G→A（rs20541）和-1112C→T（rs1800925）位点与哮喘遗传性具有强烈的相关性[9-10]。

在本研究中，两组+2044G→A（rs20541）基因型频率分布表现出显著差异。而-1112C→T（rs1800925）的基因型频率分布无显著差异。本研究的患者均来自于中国浙江地区，而且研究的样本数又相对偏小，所以研究结果与以前文献报道可能会存在有一些差异。

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