液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中9种青霉素

李学民，母健，王蕾，曹彦忠，张进杰

（秦皇岛出入境检验检疫局，河北 秦皇岛 066004）

液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中9种青霉素

李学民，母健，王蕾，曹彦忠，张进杰

（秦皇岛出入境检验检疫局，河北 秦皇岛 066004）

建立了用液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）测定蜂蜜中9种青霉素残留量的分析方法.3g蜂蜜样品用25mL pH＝8.5的0.15mol／L磷酸二氢钠缓冲溶液溶解，用Oasis HLB固相萃取柱净化，目标物用乙腈-水（体积比1∶1）洗脱，定容收集液至3mL.采用电喷雾电离，正离子扫描，多反应监测（MRM）模式检测.0.5，1.0，2.0，5.0μg／kg 4个添加水平的回收率为76.9%～104.3%；相对标准偏差为3.29%～9.12%；方法定量限是：青霉素 G、乙氧萘青霉素为0.5μg／kg，氧哌嗪青霉素、青霉素V、苯唑青霉素为1.0μg／kg，羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素为2.0μg／kg.

液相色谱-串联质谱；蜂蜜；9种青霉素

青霉素类抗生素是β-内酰胺类药物的重要代表之一，用于治疗革兰氏阳性菌引起的各种感染.养蜂业常用它治疗蜜蜂感染幼虫腐臭病［1］.用药方式通常是将抗生素添加到糖水或蜜汁里饲喂蜜蜂，从而达到治疗或预防蜂病的目的.这就可能使药物混入蜂蜜中而导致抗生素残留.据文献报道［2］，青霉素最主要的不良反应，可产生各种过敏反应，严重的出现过敏性休克，同时还能产生耐药性，对人体健康造成危害.因此，世界各国对动物源食品中青霉素残留量均提出了限量要求［8、15］，如美国规定牛组织中青霉素最高残留限量（MRL）为10～50μg／kg，欧盟规定牛奶中青霉素最高残留限量（MRL）为4～30μg／kg.

测定牛奶、动物组织和体液中青霉素残留量的检测技术，在美国和欧盟等国家采用了多种方法，已见报道的分析方法有：微生物法［3］，该方法只能测定青霉素的总量；酶联免疫法［4］，主要作为青霉素残留量检测的筛选方法；薄层色谱法［5］，所需设备简单，应用范围小，检测周期长；极谱法［6］，该方法适用性不强；气相色谱法［7］，该方法需经过提取、甲基化、净化、衍生化等步骤，在德国曾经作为临时性官方方法；高效液相色谱法［8-10］，分别采用柱前衍生和柱后衍生，使用的检测器有紫外检测器、荧光检测器和电化学检测器；液相色谱串联质谱法［11-20］，这类方法样品前处理大多数采用固相萃取技术，对青霉素类既可定性又可定量，方法检出限较低（0.4～5μg／kg）.

在实验中主要参考了文献［8，10，14，17，18］，重点研究了9种青霉素从蜂蜜中提取和净化效果.确定了用磷酸二氢钠缓冲溶液提取，通过固相萃取柱净化，用液相色谱-串联质谱仪测定.该方法操作简单，结果准确，是一种既能定性又能定量的检测方法，完全满足对9种青霉素残留限量的要求.

1 实验部分

1.1 试剂与材料

甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；乙酸（优级纯）；羟氨苄青霉素（CAS26787-78-0）、氨苄青霉素（CAS69-53-4）、氧哌嗪青霉素（CAS59703-84-3）、青霉素 G（CAS69-57-8）、青霉素 V（CAS132-98-9）、乙氧萘青霉素（CAS7177-50-6）、苯唑青霉素（CAS7240-38-2）、邻氯青霉素（CAS642-78-4）、双氯青霉素（CAS13412-64-1）标准物质（Sigma公司）；9种青霉素标准储备溶液：准确称取适量的标准物质，分别用水配制成浓度为1.0mg／mL的标准储备溶液.储备液储存在-25℃冰柜中；9种青霉素标准工作溶液：根据需要吸取适量标准储备溶液，用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液；磷酸二氢钠（优级纯，无水）；氢氧化钠（优级纯）；磷酸盐缓冲溶液（0.15mol／L，pH＝8.5：称取18g磷酸二氢钠溶于1 000mL水中，用5mol／L氢氧化钠溶液调节pH＝8.5）；固相萃取柱（Oasis HLB，C18 500mg：使用前分别用5mL甲醇、10mL水和5mL磷酸盐缓冲溶液预处理，保持柱体湿润）.

1.2 仪器与设备

液相色谱-串联四极杆质谱仪配有电喷雾离子源（API 3000，美国应用生物系统公司）；液相色谱仪（Angilent 1100）；液体混匀器；玻璃固相萃取装置；真空泵；pH计，测量精度±0.02（瑞士Precisa pH900型）.

1.3 测定条件

液相色谱条件 色谱柱：SunFireTMC 18 3.5μm ，150mm×2.1mm；流速200μL／min；柱温：30℃；进样量：20μL；流动相：乙腈（A）和0.3%乙酸水溶液（B），梯度洗脱程序为体积分数5%A保持3min，然后在10min内将A体积分数增加至50%，随后在5min内增加至75%，最后在7min内降低A至5%.

质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；喷雾电压（IS）：5 500V；雾化气（NEB）：0.055MPa；气帘气（CUR）：0.079MPa；辅助气（AUIX）：6L／min；离子源温度400℃.

定性离子对、定量离子对和去簇电压（DP）、聚焦电压（FP）、碰撞能量（CE）及碰撞室出口电压（CXP）见表1.

1.4 操作步骤

称取3g试样（精确到0.01g）置于150mL三角瓶中，加入25mL磷酸盐缓冲溶液，于液体混匀器上混合1min，使试样完全溶解，用5mol／L氢氧化钠溶液调节样液，使样液pH＝8.5.样液移至下接已预处理的固相萃取柱的储液器中，在玻璃固相萃取器上（陕西奥联科技发展有限公司），以小于或等于3mL／min的流速通过固相萃取柱后，用2mL水洗柱，弃去全部流出液.用3mL乙腈-水（体积比1∶1）洗脱，收集洗脱液于刻度样品管中，用乙腈-水（体积比1∶1）定容至3mL，摇匀、过滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定.

表1 9种青霉素的定性离子对、定量离子对、去簇电压、聚焦电压、碰撞能量和碰撞室出口电压Tab.1 Some parameters of multiple reaction monitoring detection for 9penicillins

2 结果与讨论

2.1 固相萃取柱的选择

在本方法的研究中，笔者用Oasis HLB，ENVI-18，Octadecyl C18，LiChrolut EN和Sep-Pak C18共5种固相萃取柱对9种青霉素的提取和净化效果进行了对比研究.实验发现，Sep-Pak C18固相萃取柱回收率低（只有50%～60%），且净化效果也不理想，这是该固相萃取柱填料中含碳量小于14%所致.而ENVI-18、Li-Chrolut EN和Octadecyl C18 3种固相萃取柱对羟氨苄青霉素和氨苄青霉素的回收率低，还存在着不同批次之间回收率的显著差异.使用Oasis HLB固相萃取柱对蜂蜜中9种青霉素的回收率进行测定，9种青霉素回收率及重现性均适用蜂蜜样品.因此，本方法选择Oasis HLB固相萃取柱净化样品.

2.2 提取溶液的选择

分别用去离子水、质量分数为4%氯化钠溶液和磷酸二氢钠缓冲溶液（0.15mol／L，pH＝8.5）做为提取液，进行蜂蜜样品中9种青霉素回收率实验.实验发现，当用去离子水和质量分数为4% 氯化钠溶液作为提取液时，羟氨苄青霉素和氨苄青霉素的回收率均小于30%，其他7种青霉素在81.5%～102.0%.在使用磷酸二氢钠缓冲溶液提取液时，9种青霉素回收率都超过65%.故选择磷酸二氢钠缓冲液做提取液.

由于磷酸二氢钠缓冲溶液浓度和pH值对羟氨苄青霉素和氨苄青霉素的回收率影响较大，对此分别进行实验.分别配制0.033～0.2mol／L不同浓度的磷酸二氢钠缓冲溶液和0.15mol／L pH值分别为4.2～9.5磷酸二氢钠缓冲溶液，进行羟氨苄青霉素和氨苄青霉素的回收率实验，结果见表2.

表2 磷酸二氢钠缓冲溶液不同浓度和pH值对羟氨苄青霉素和氨苄青霉素回收率的影响Tab.2 Effects of buffer concentration and pH on the recoveries of hydroxyl ampicillin and amoxicillin penicillin

实验表明，磷酸二氢钠浓度在0.033～0.1mol／L时，羟氨苄青霉素回收率重现性不好，磷酸二氢钠浓度超过0.17mol／L时，峰形变宽，容易导致样液过柱慢.氨苄青霉素在磷酸二氢钠浓度超过0.05mol／L时其回收率已经满足工作需要，因此，确定0.15mol／L的磷酸二氢钠缓冲溶液作为提取液.磷酸二氢钠缓冲溶液pH值对羟氨苄青霉素回收率的影响大于氨苄青霉素，当磷酸二氢钠缓冲溶液pH值为8.0～9.0时，羟氨苄青霉素和氨苄青霉素均获得满意的回收率.当磷酸二氢钠缓冲溶液pH值超过9.5时，氧哌嗪青霉素的回收率逐渐降低.因此，确定磷酸二氢钠缓冲溶液pH值是8.5.

2.3 固相萃取柱洗脱条件的选择

本方法比较了1，2，3，4mL乙腈-水（体积比1∶1）作为固相萃取柱的洗脱剂对9种青霉素回收率产生的影响，结果见图1.实验表明，当洗脱剂用量小于3mL时，羟氨苄青霉素、氨苄青霉素和青霉素V的回收率偏低，其他6种青霉素的回收率为80.8%～94.7%.当洗脱剂用量为3mL时，9种青霉素回收率为95.6%～102.4%.当洗脱剂用量为4mL时，9种青霉素回收率没有明显改善.因此，本方法选用3mL乙腈-水（体积比1∶1）作为固相萃取柱的洗脱剂.

图1 固相萃取柱洗脱剂用量对回收率的影响Fig.1 Effects of eluant volume of SPE on the recoveries of 9penicillins.

2.4 测定条件的选择

a）液相色谱条件的选择

分别对μBondapak C18 300mm×4.0mm色谱柱和SunFireTM 3.5μm C18 150mm×2.1mm色谱柱进行了比较.实验发现，这2种色谱柱的灵敏度均能满足要求，但μBondapak C18色谱柱对邻氯青霉素和乙氧萘青霉素分离度不如SunFireTM 3.5μm C18色谱柱好，μBondapak C18柱流速在1.5mL／min，进质谱仪之前需要分流，而分流时对青霉素结果的测定产生一定误差，而使用SunFireTM 3.5μm C18柱不需分流，定量准确度优于μBondapak C18柱，通过以上对2种色谱柱的比较，本方法选用SunFireTM 3.5μm C18为9种青霉素的分析柱.

b）质谱条件的选择

采用注射泵直接进样方式，以5μL／min分别将羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、氧哌嗪青霉素、青霉素G、青霉素V、苯唑青霉素、邻氯青霉素、乙氧萘青霉素、双氯青霉素标准溶液注入离子源，用正离子检测方式对9种青霉素进行一级质谱分析（Q1扫描），得到质子化分子离子峰分别为366，350，518，335，351，402，436，415和470.

再对分子离子进行二级质谱分析（子离子扫描），得到碎片离子信息.然后对去簇电压（DP），碰撞气能量（CE），电喷雾电压、雾化气和气帘气压力进行优化，使分子离子与特征碎片离子对强度达到最佳.然后将质谱仪与液相色谱联机，再对离子源温度，辅助气流速进行优化，使样液中9种青霉素离子化效率达到最佳.

2.5 线性范围和方法检出限

配制含羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、氧哌嗪青霉素、青霉素G、青霉素V、苯唑青霉素、乙氧萘青霉素质量浓度分别为1.0，5.0，10，50，100，200ng／mL；邻氯青霉素、双氯青霉素质量浓度分别为2.0，10，20，100，200，400ng／mL的蜂蜜基质混合标准溶液，在选定的条件下进行测定，进样量为20μL，用峰面积对标准溶液中各被测组分的浓度做图，羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、氧哌嗪青霉素、青霉素G、青霉素V、苯唑青霉素、乙氧萘青霉素的绝对量分别为0.02～4ng；邻氯青霉素、双氯青霉素的绝对量分别在0.04～8ng内均呈线性关系，符合定量要求，其线性方程和校正因子见表3.

表3 9种青霉素线性方程和相关系数Tab.3 Linearity of 9penicillins in a analyte-free honey.

在该方法操作条件下，9种青霉素在添加水平0.5～20μg／kg时，各自的测定响应值在仪器线性范围之内.同时，样品中青霉素G、乙氧萘青霉素的添加量为0.5μg／kg；氧哌嗪青霉素、青霉素V、苯唑青霉素的添加量为1.0μg／kg；羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素的添加量为2.0μg／kg时，所测谱图的信噪比远大于10.因此，确定本方法的定量限，青霉素G、乙氧萘青霉素为0.5μg／kg；氧哌嗪青霉素、青霉素V、苯唑青霉素为1.0μg／kg；羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素为2.0μg／kg.

2.6 方法的回收率和精密度

用不含青霉素的蜂蜜样品进行添加回收率和精密度实验，样品中添加0.5，1.0，2.0，5.0μg／kg 4个不同浓度标准后，摇匀，然后按本方法进行提取和净化，用高效液相色谱-串联质谱仪测定，其回收率和精密度见表4.从表中回收率及精密度数据可以看出，本方法回收率为76.9%～104.3%，4个添加水平的相对标准偏差为3.29%～9.12%.

表4 9种青霉素添加回收率及精密度（n＝6）Tab.4 Spiked recoveries and precisions of 9 penicillins in a blank honey（n＝6）

2.7 方法的适用性

笔者采用本方法对葵花蜜、棉花蜜、油菜蜜和梧桐蜜等10个不同蜜种，在4个添加水平检查方法的适用性，9种青霉素的回收率为65.5%～105.7%，相对标准偏差为5.79%～9.90%，说明方法的适用性很好.

［1］ 江西省养蜂研究所主编.养蜂手册［M］.北京：农业出版社，1975.

JIANGXI INSTITUTE OF BEEKEEPING.beekeeping Handbook editor［M］.Beijing：Agricultural Press，1975.

［2］ 阎继业.畜禽药物手册［M］.北京：金盾出版社，1990.

YAN Jiye.Edited by Animal Drug Handbook［M］.Beijing：the Golden Shield Press，1990.

［3］ GB／T 18932.9—2002，蜂蜜中青霉素残留量的测定方法-杯碟法 ［S］.

［4］ MITCHELL J M，YEE A J，MCNAB W B，et al.Validation of the LacTek test applied to spiked extracts of tissue samples：determination of performance characteristics［J］.Jounrnal of AOAC International，1999（82）：79-84.

［5］ MOATS W A.Detection and semiquantitative estimation of penicillin G and cloxacillin in milk by thin-layer chromatography［J］.J Aqric Food Chem ，1983（31）：1348-1350.

［6］ SCHROEDER B，VOIGT R，PATSCH R，et al.Pulse-polarographic determination of beta-lactam antibiotica and its clinical applications［J］.Anal Chem，1988（331）：529-530.

［7］ 李俊锁，邱月明，王超.兽药残留分析［M］.上海：上海科学技术出版社，2000.

LI Junsuo，QIU Yueming，WANG Chao.Veterinary drug residue analysis［M］.Shanghai：Shanghai Science and Technology Publishing House，2000.

［8］ BOISON J O，KENY L J Y.Multiresidue liquid chromatographic method for determining residues of mono-and dibasic penicillins in bovine muscle tissues［J］.J AOAC，1998（81）：1113-1120.

［9］ 王超，李淑娟.测定牛奶中五种青霉素残留量的高效液相色谱柱前衍生法［J］.分析测试学报，2000，19（6）：72-74.

WANG Chao，LI Shujuan.Determination of five penicillin residues in milk by high performance liquid chromatography with precolumn derivatization method［J］.Journal of instrumental analysis，2000，19（6）：72-74.

［10］ VERDON E，COUEDOR P.A high-performance liquid chromatographic multiresidue method was developed for the determination of 8penicillin compounds at trace levels in muscle tissue［J］.J AOAC Int，1999（82）：1083-1095.

［11］ BLANCHFLOWER WJ，HEWITT S，A，KENNEDY D G.Confirmatory assay for the simultaneous detection of five penicillins in muscle，kidney and milk using liquid chromatography-electrospray mass spectrometry［J］.Analyst，1994（119）：2595-2601.

［12］ STRAUB RF，LINDER M，VOYKSNER RD.Determination of beta-lactam residues in milk using perfusive-particle liquid chromatography combined with ultrasonic nebulization electrospray mass spectrometry［J］.Anal Chem，1994（66）：3651-3658.

［13］ TYCZKOWSKA K L，VOYKSNER R D，STROUB，et al.Simultaneous multiresidue analysis ofβ-Lactam antibiotics in bovine milk by liquid chromatography with ultraviolet detection and confirmation by electrospray mass spectrometry［J］.J AOAC，1994（77）：1122-1131.

［14］ BRUNO F，CURINI R，CORCIA A，et al.Solid-phase extraction followed by liquid chromatography-mass spectrometry for trace determination of beta-lactam antibiotics in bovine milk［J］.J Aqric Food Chem，2001（49）：3463-3470.

［15］ RIEDIKER S，DISERENS J M ，STADLER R H.Analysis of beta-lactam antibiotics in incurred raw milk by rapid test methods and liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.J Aqric Food Chem，2001（49）：4171-4176.

［16］ RIEDIKER S，STADLER R H.Simultaneous determination of five beta-lactam antibiotics in bovine milk using liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Anal Chem，2001（73）：1614-1621.

［17］ BECKER M，ZITTLAU E，PETZ M.Residue analysis of 15penicillins and cephalosporins in bovine muscle kidney and milk by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta，2004（520）：19-32.

［18］ WANG J.Confirmatory determination of six penicillins in honey by liquid chromatography／electrospray ionization-tandem mass spectrometry［J］.J AOAC Int，2004（87）：45-55.

［19］ HELLER D N，NOCHETTO C B，RUMMEL N G，et al.Development of multiclass methods for drug residues in eggs：hydrophilic solid-phase extraction cleanup and liquid chromatography／tandem mass spectrometry analysis of tetracycline，fluoroquinolone，sulfonamide，and beta-lactam residues［J］.Food Chem，2006（54）：5267-5278.

［20］ HAMMEL Y A，MOHAMED R，GREMAUD E，et al.Multi-screening approach to monitor and quantify 42antibiotic residues in honey by liquid chromatography-tandem mass apectrometry［J］.PA J Chromatogr A，2008（1177）：58-76.

Determination of 9 penicillins in honey by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LI Xuemin，MU Jian，WANG Lei，CAO Yanzhong，ZHANG Jinjie
（Qinhuangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qinhuangdao 066004，China）

A method was described for the determination of 9penicillins in honey by LC-MS-MS.3.0g honey samples were dissolved in 25mL sodium dihydrogen phosphate buffer solution（pH＝8.5），and then cleaned up with Oasis HLB SPE cartridge.The target compounds were eluted with acetonitrile-water（1∶1），and the elution was determined to a volume of 3mL.MS detection was performed in the positive ion mode using multiple reaction monitoring（MRM）.Limit of quantification（LOQ）for the method of 9penicillins was between 0.5 2.0μg／kg.Average recoveries at four fortification levels（0.5，1.0，2.0，5.0μg／kg）in honeywere 76.9%104.3%，relative standard deviation were 3.29%9.12%.

LC-MS-MS；honey；9penicillins

O177.91

A

1000-1565（2012）05-0492-07

2012-01-20

国家标准研制资助项目（20040032-T-442）

李学民（1964-），男，河北卢龙人，秦皇岛出入境检验检疫局高级工程师，主要从事农兽药残留分析研究.

E-mail：ciqlixm＠163.com

梁俊红）