聚（NIPAAM－EDMA）整体柱的制备及其对尿样中氢化可的松的富集分析

贾艳花，刘海燕，杨宁，段艳慧，杨更亮

（河北大学药学院，河北保定 071002）

聚（NIPAAM－EDMA）整体柱的制备及其对尿样中氢化可的松的富集分析

贾艳花，刘海燕，杨宁，段艳慧，杨更亮

（河北大学药学院，河北保定 071002）

以N－异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，制备了一种能有效去除尿样中的大分子物质，并能同时富集尿样中氢化可的松的整体柱.实验结果表明：氢化可的松在5～30 mg／L线性关系良好（R＝0.999 3，n＝6），检测限为0.012 mg／L；绝对回收率79%～83%；日内、日间精密度均＜5.0%，整体柱能够很好地富集尿样中的氢化可的松，并且能很好地除去尿样中的大分子物质及杂质，能满足分析的要求.

N－异丙基丙烯酰胺；整体柱；富集分析；氢化可的松

整体柱又称为棒状柱、连续床层、无柱塞柱，是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相，作为一种新型的分离介质已经用在液相色谱和毛细管色谱上［1－2］.自20世纪80年代末出现以来，合成了不同种类的整体柱新型材料，并通过在固定相上做不同的衍生制备了很多具有功能性的整体柱.氢化可的松是天然的皮质激素类的药物，有抗炎、抗毒、抗休克的作用.目前人们对样品中氢化可的松及其他激素类药物的分析主要是高效液相色谱法［3－4］、反向流动注射－化学发光法［5］、高效液相色谱－质谱法［6］、气相色谱法－质谱法［7］等，但均操作较复杂，过程较繁琐.本实验以N－异丙基丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈作为引发剂，制备了一种新型整体柱材料，整体柱做为尿样中氢化可的松的富集柱，能够除去尿样中的生物大分子物质和尿样中其他成分的干扰，对氢化可的松有很好的保留，实现对氢化可的松的快速、简便、有效富集，并联合C18柱进行分析测定.

图1 氢化可的松的结构式Fig.1 Chemical structure of hydrocortisone

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

主要仪器：P3000高效液相色谱仪（中国，北京创新通恒科技有限公司）；UV－3000紫外／可见分光检测器（中国，北京创新通恒科技有限公司）；色谱工作站CXT H－3000（北京创新通恒科技有限公司）；ODS C18柱（依利特，150 mm×4.6 mm i.d.，5μm）；不锈钢空色谱柱管（10 mm×4.6 mm i.d.）；SZ－97自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；HH－601超级恒温水浴（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）.

N－异丙基丙烯酰胺（NIPAAM，分析纯，日本Tokyo Kasei Kogyo公司），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，分析纯，美国acros公司），十六醇（分析纯，天津天泰化工精细化学品有限公司），偶氮二异丁腈（AIBN，分析纯，上海试剂四赫维化有限公司），甲醇（分析纯，北京益利精细化学品有限公司）；尿液由健康志愿者提供.

1.2 整体柱的制备

将NIPAAM（0.075 g），EDMA（0.7 m L），AIBN（0.003 g），十六醇（0.045 g），甲醇（1.3 m L）依次加入到试管中，经混合、超声、通氮气10 min，转移到干净、干燥的不锈钢色谱柱管中，抽真空20 min密封，在60℃恒温的条件下反应24 h.将取出的柱体放至常温后，分别用甲醇和水冲柱，将柱中的残余的致孔剂和其他可溶性的物质除去，即可得到整体柱.

1.3 样品的制备

精密称取适量的氢化可的松制备成1.0 g／L的标准储备液（放于冰箱中保存），用于配制5～30 mg／L的尿液样品.

1.4 色谱分析的条件

富集柱：自制整体柱；流动相：水；流速：1.0 m L／min；检测波长280 nm.

分析柱：C18柱（依利特，150 mm×4.6 mm i.d.，5μm）；流动相：甲醇－水（V（甲醇）∶V（水）＝60∶40）；流速1.0 m L／min；检测波长245 nm.

1.5 样品处理与色谱分析

将自制整体柱连接在高效液相色谱仪上，按照1.4节色谱条件，即先在280 nm处连接整体柱对尿样中的药物进行富集，富集完全后停泵，将C18柱与整体柱连接，在245 nm下进行分析.

2 结果与讨论

2.1 整体柱的表征

2.1.1 柱压和流速的关系

分别以甲醇和水为流动相考察了整体柱的柱压降与流速的关系，从图2可以看出柱压降与流速呈良好的线性关系，随着流速的增加，柱背压呈现线性的变化，以甲醇为流动相，当流速为3 m L／min时，柱背压为2.3 MPa，结合图3可看出整体柱的骨架结构中具有大小不等的微孔，所以整体柱具有良好的通透性.

图2 整体柱柱压降与流速的关系Fig.2 Effect of flow rate on back pressure

2.1.2 扫描电镜

图3为整体柱的电镜图，聚合物的结构是由球形束和束间不规则的孔组成，束间孔相互贯通，可以通过流动相，为固相萃取提供比较大的表面积，而且也可用于高流速分析.

图3 整体柱的电镜Fig.3 SEM image of the cross sectional view of the monolithic column

2.1.3 红外图谱

由红外图谱4看出，3 100 cm－1附近的－C＝C－上特征峰消失，在1 180 cm－1处的酯键中－C－O－基的吸收峰在连接上EDMA后明显地增强，在1 680 cm－1处－C＝O的吸收峰明显增强.

图4 整体柱的红外谱Fig.4 FT－IR spectra of monolithic column

2.2 氢化可的松的富集及分析

2.2.1 流动相对药物保留的影响

以水为流动相，以整体柱为色谱柱，取适量氢化可的松进样，如色谱图5b；在同样条件下将等量的氢化可的松以空柱管为柱体进样，如图5a.从图中可以看出以水为流动相时药物保留强，基本不出峰，而空柱管出峰比较大，因此，以水做流动相可以很好地将药物富集在整体柱上.

图5 氢化可的松上样于空柱管和整体柱Fig.5 Solution of Hydrocortisone injected into the connecting tube and the monolithic column

2.2.2 尿样洗脱

以水为流动相，将5μL的空白尿样直接进入整体柱，从图6中可以看出尿样在3 min之内出峰完毕.

图6 空白尿样洗脱色谱Fig.6 Chromatograms obtained from blank urine eluting

2.2.3 药物的分析

按照1.5的操作，分别将5μL含有氢化可的松的尿样和空白尿样进样，以水为流动相时，样品通过整体柱富集，富集完全后，停泵；在仪器稳定后，串联C18柱进行分析，将整体柱上富集的氢化可的松洗脱下来（色谱图见图7）.

图7 空白尿样和氢化可的松的色谱Fig.7 Chromatograms obtained from blank urine and urine spiked with hydrocortisone

从图7可以看出，空白尿样（图7a）在药物出峰的位置没有杂峰出现，尿样并不影响药物的分析，而含有氢化可的松的尿样（图7b）在5.2 min处出现药物峰，因此可用来对氢化可的松的富集分析.

2.3 方法性能指标考察

2.3.1 标准曲线

准确称取氢化可的松标准储备液，用尿液依次稀释制备为质量浓度5，10，15，20，25，30 mg／L系列溶液.按照1.5节的操作，每个质量浓度进样品3次.以色谱峰面积Y对血药质量浓度X（mg／L）作图，回归方程为Y＝1.8691×103X－52.4，r＝0.999 3（n＝6），在5～30 mg／L内具有良好的线性.当仪器的信噪比（S／N）为3时，测得氢化可的松的检测限0.012 mg／L.

2.3.2 精密度和回收率

准确配制氢化可的松5，15，30 mg／L 3种质量浓度尿液样品和同质量浓度的对照液各5份，尿液样品按照1.5节的过程进样分析，对照液直接进C18柱分析.用上面所得的值计算日内、日间精密度及其回收率、绝对回收率.具体结果见表1.

表1 尿样中氢化可的松的精密度、回收率、准确度Tab.1 Precision accuracy and recovery of hydrocortisone in urine sample

3 结论

实验采用自制的整体柱作为富集柱，能够除去尿样中的大分子，尿样无需处理可以直接进样，避免了生物样品繁琐的预处理过程.实验结果表明本方法具有良好的线性范围、回收率和精密度，能够满足生物样品分析测定的要求，本整体柱制备简单，重复利用，成本低廉，为检测样品中痕量药物的简便、快速、有效方法.

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Preparation of poly（NIPAAM－EDMA）monolithic column for enriching and analyzing hydrocortisone from urine

JIA Yan－hua，LIU Hai－yan，YANG Ning，DUAN Yan－hui，YANG Geng－liang
（College of Pharmacy，Hebei University，Baoding 071002，China）

A new monolithic column have been prepared which was composed of copolymer that theN－isopropylacrylamide（N－IPAAM）was the monomer and the ethyleneglycoldimethacrylate（EDMA）was the cross－linker.The monolith was used for removing the macromoleculer and enriching the hydrocortisone in urine sample.The result showed that hydrocortisone had a good linear（R＝0.999 3，n＝6）when the concentration of the hydrocortisone in the range of 5－30 mg／L，the limit of detection（LOD）was 0.012 mg／L.The absolutely recovery was 79%－83%.The inter－day RSD and intra－day RSD was less than 5%.This method is conforming to analysis.

N－isopropylacrylamide；monolithic column；enrichment analysis；hydrocortisone

R917

A

1000－1565（2012）02－0154－05

2011－10－20

国家自然科学基金资助项目（21175031），河北省科技厅资助项目（11966411D）；河北省教育厅资助项目（2008416，ZD2010234）；科技部“重大新药创制”科技重大专项“十二五”计划第二批课题（2012ZX09103－101－057）；河北大学自然科学基金资助项目（2009－165）.42

贾艳花（1984－），女，河北行唐人，河北大学在读硕士研究生.

刘海燕（1971－），女，河北保定人，河北大学副教授，主要从事色谱分离材料的制备及应用研究.

E－mail：lhy1610＠126.com

梁俊红）