河北产蜂胶提取物对痤疮丙酸杆菌的抑制作用*

张芳英，杨继章，杨树民，穆丽娟，张旭东，张征

(1.河北医科大学第一医院药剂科，石家庄 050031;2.河北省人民医院药剂科，石家庄 050051)

痤疮是青少年常见的、多发的皮脂腺疾病，其发病与激素水平、毛囊皮脂腺导管角化异常和微生物感染等诸多因素有关［1］。痤疮的常见致病菌是痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，而痤疮丙酸杆菌与痤疮的发生及炎症反应的加重有明确关系。减少皮肤毛囊中主要致病菌的数量是治疗痤疮的主要途径之一。蜂胶是一种具有广泛药理作用的天然产物，具有很强的抗微生物活性，国内外对蜂胶的抗菌作用多有报道［2］。在临床各领域均有应用，尤其内服、外用在皮肤病方面，包括各种皮炎、痤疮、银屑病、烧烫伤等均有疗效［3］。为探讨蜂胶提取物治疗痤疮的可行性，本课题组用不同溶剂、不同浓度的河北产蜂胶对痤疮常见致病菌做了系列研究，笔者就河北产蜂胶提取物对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用报道如下。

1 材料与方法

1.1 试药 蜂胶(河北安国养蜂场提供原蜂胶)。

1.2 仪器 DH3600AB型电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司);96孔一次性使用培养板(浙江拱东医用塑料厂);连续微量加样器(美国Eppendorf公司);厌氧罐(河北省人民医院提供)。

1.3 菌株及试剂 痤疮丙酸杆菌冻干菌株(ATCC11827，购于广东省微生物研究所)，BD BACTECTMLytic/10 Anaerobic/F(Becton，Dickinson and Company Sparks，MD21152，河北医科大学第一医院检验科提供)，疱肉培养基(河北省人民医院提供)。95%乙醇，75%乙醇，纯化水，灭菌0.9%氯化钠溶液。

1.4 药液的制备 称取原蜂胶10 g，3份，冷冻24 h后粉碎成颗粒，放入无菌玻璃瓶中，分别用95%乙醇、75%乙醇、纯化水各100 mL浸泡粉碎后的颗粒，放置阴凉避光处，每日振荡3或4次，2周后取滤纸过滤，得各溶剂蜂胶提取液，其浓度为100 mg·mL－1。再分别取不同溶剂提取蜂胶液1 mL，用连续微量加样器加入灭菌0.9%氯化钠溶液11.207 mL，配制成最终浓度为 8192 μg·mL－1的蜂胶液备用。

1.5 菌种复苏 在无菌条件下从保存菌种斜面上沾取一定量痤疮丙酸杆菌，接种在疱肉培养基上放入厌氧罐中，先抽真空，再充入10%氢气、5%二氧化碳、平衡氮气混合气体，在无氧条件下放入电热恒温培养箱37℃培养48 h，备用。

1.6 菌悬液制备 用无菌接种环挑取培养基上痤疮丙酸杆菌，用BD培养液、灭菌0.9%氯化钠溶液校正至0.5麦氏比浊标准，再用BD培养液1∶100倍稀释，至菌悬液浓度为 1×106cfu·mL－1。

1.7 最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的测定

1.7.1 微量板制备及点种 取一次性无菌96孔U型底培养板一个，向每孔加入BD培养液100 μL，在每排的第1孔分别加入浓度为8192 μg·mL－1的蜂胶95%乙醇、75%乙醇和水提取液 100 μL，然后吸取100 μL至第2孔，混匀后再吸取100 μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第11孔，并从第11孔中吸取100 μL弃去，第12孔为不含药物的生长对照。再向第1～11孔每孔分别加入痤疮丙酸杆菌菌悬液100 μL，至此，药物最终浓度为 2048 ，1024 ，512，256，128，64，32，16，8，4 μg·mL－1。操作全过程均为无菌操作。

1.7.2 菌株的培养 将培养板放入厌氧罐中，先抽真空，再冲入10%氢气、5%二氧化碳、平衡氮气混合气体，放入电热恒温培养箱中在37℃条件下培养48 h。

1.7.3 判断标准 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，当阳性对照孔内细菌明显生长实验才有意义。

2 结果

蜂胶95%乙醇提取液、蜂胶75%乙醇提取液、蜂胶水提取液对痤疮丙酸杆菌 MIC值分别为512，8，54 μg·mL－1，可见对痤疮丙酸杆菌均有抑菌作用，其中蜂胶75%乙醇提取液的MIC值最小，抑菌效果最好。

3 讨论

痤疮的治疗药物种类繁多，维A酸类和抗菌药物是临床上较常使用的药物。维A酸类外用和口服均有一定的不良反应，外用可引起皮肤刺激、红斑及脱屑。抗菌药物多为米诺环素、克林霉素、红霉素，长期及不规则用药可引起细菌耐药。国内外很多文献报道了蜂胶对细菌有较好的抑制作用，但笔者未见对痤疮丙酸杆菌抑菌活性的研究报道。近年来，中药提取物对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用亦多见报道，如大黄游离蒽醌、大黄、黄芩、金银花、黄柏等14味中药对痤疮丙酸杆菌均有抑菌作用［4-5］。与本实验结果比较蜂胶醇提取物对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用优于其他中药提取物。

蜂胶的药用价值是它作为一种天然混合物表现出来的，蜂胶萃取物含有200多种物质，含有的抗菌成分主要有高良姜素、短叶松素、白杨素、乔松素、5-羟-7，4，二甲氧黄酮、双氢黄酮、阿魏酸等，并证明了蜂胶的抗菌作用是多种成分协同的结果。蜂胶的抗菌、杀菌作用机制十分复杂，蜂胶能破坏细菌细胞壁、细胞质、细胞膜的结构，产生溶菌作用，并能抑制细菌蛋白质的合成，其确切作用机制还有待进一步研究探讨。国内外研究均表明不同提取方法、不同提取溶媒蜂胶表现出不同的药理作用。本实验结果也表明不同溶剂的蜂胶提取物对痤疮丙酸杆菌的抑菌浓度不同，均表现出良好的抑菌效果。

蜂胶由于地域的不同，其化学成分、抗菌作用也存在一定差异。国外对不同地域产蜂胶的抗菌作用的研究报道较多，国内在这一领域的研究较少。曾莉萍等［6］用河南产蜂胶乙醇提取物对常见细菌的抗菌作用进行了系统研究，得出结论为蜂胶乙醇提取物对甲型链球菌、乙型链球菌、白念珠菌、金黄色葡萄球菌及其耐药菌株、白喉杆菌、溶壁微球菌均有抗菌作用。对厌氧菌的报道只检索到熊萍等［7］报道了云南蜂胶75%乙醇蜂胶液对牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌(Pg)、具核梭杆菌(Fn)、放线杆菌(Aa)的抑制作用，结果蜂胶乙醇溶液对3种细菌都有抑制作用，对Pg、Fn、Aa的 MIC 分别为 6.25，12.50，25.00 μg·mL－1。本实验结果表明河北产蜂胶提取物对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用较好。

研究发现，蜂胶中大量有效成分可以净化血液，营养肌肤，抑制过氧化脂质生成，抑制酪氨酸酶活性，又可以吸收紫外线，从而保护肌肤，祛斑，增白［8］。张天宝等［9］用蜂胶乙醇提取物对家兔进行皮肤急性毒性实验、皮肤刺激实验及豚鼠过敏实验，未出现毒性反应和死亡，也未见皮肤充血、红肿等不良反应，对豚鼠重复接触，也未见皮肤出现抗体免疫反应。鉴于蜂胶的上述优点，结合本课题前期研究结果——河北产蜂胶醇提取物对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌具有良好的抗菌作用，得出河北产蜂胶醇提取物对痤疮常见致病菌具有良好的抗菌作用，为进一步研究开发蜂胶制剂治疗痤疮提供了科学的依据。

［1］赵辨.临床皮肤病学［M］.3版.南京:江苏科学技术出版社，2009:935.

［2］张芳英，穆丽娟，杨继章.蜂胶提取物抗菌作用的研究进展［J］.中国药房，2011，22(11):1041－1043.

［3］李泽民，井玥，赵余庆.蜂胶国内外临床应用研究进展［J］.中国药房，2007，18(2):146－147.

［4］陈红斌，陈钧.大黄对痤疮主要致病菌的体外抑菌作用研究［J］.中药药理与临床，2006，22(3):111－113.

［5］朱亚芳，赵浩如.中药体外抑制痤疮丙酸杆菌的活性测定［J］.药学与临床研究，2009，17(3):224－226.

［6］曾莉萍，许兵红，李进芬.蜂胶对链球菌的抑菌实验［J］.现代预防医学，2007，34(16):3042－3043.

［7］熊萍，张明珠，雷雅燕，等.云南蜂胶对3种牙周致病菌的抑制作用［J］.昆明医学院学报，2009，30(9):23－24.

［8］张悦，韩银淑，王丽敏.蜂胶——21世纪的药源［J］.齐齐哈尔医学院学报，2000，21(4):462.

［9］张天宝，黄晓波，岳木生.蜂胶复方消毒剂杀菌效果与毒性的实验观察［J］.中国消毒学杂志，2000，17(4):203－206.