血管内皮生长因子治疗缺氧缺血性脑损伤的研究进展

卢保霞(综述)，徐家丽(审校)

(1.蚌埠医学院，安徽蚌埠 233004;2.蚌埠医学院第一附属医院儿科，安徽 蚌埠 233004)

缺氧缺血性脑病是新生儿神经系统常见病，可致严重的神经系统后遗症。我国缺氧缺血性脑病的发病率较高，而该病的治疗尚无有效的方法。近年来，国内外大量实验研究证实血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有神经保护作用，不同的用药方法(如脑室输注、静脉推注、经鼻给药、转基因治疗等)、用药时间和药物剂量使其产生神经保护作用的效果差异较大。

1 VEGF的结构及生物学活性

VEGF是Senger等［1］在肿瘤细胞中发现的，能引起小静脉对血液中大分子物质通透性改变。在血管内皮细胞上具有与VEGF高度特异性和亲和力的受体，VEGF与其结合可引起胞质内钙离子浓度短暂性升高，刺激三磷酸肌醇积聚，通过磷酸激酶特异性磷脂酶C完成自身磷酸化，促进血管内皮细胞分裂、迁移和增殖。缺氧时，VEGF可以维持内皮细胞正常结构，减少细胞凋亡的发生。

2 VEGF对缺氧缺血脑组织的保护作用

低氧作为一种信号刺激VEGF分泌并促进缺氧缺血脑组织VEGF高表达，进而促进血管内皮细胞增生，诱导大量新生血管形成，改善损伤脑组织血流供应，减轻脑损伤。同时，VEGF作为神经保护因子，减少缺血后神经细胞凋亡。

2.1 VEGF及其受体的高表达 VEGF的受体存在于血管内皮细胞、神经元、神经胶质细胞上。Gustavsson等［2］在SD大鼠缺氧预处理观察血管反应的实验中发现，无论是成年鼠还是幼鼠在缺氧合并缺血后，脑组织中VEGF及其受体表达均成倍增加。体外细胞缺氧培养时VEGF表达也上调，体外缺氧培养人骨髓间充质干细胞及大鼠脑微血管内皮细胞，培养液中VEGF显著上升，表达VEGF受体的间充质干细胞数也显著上升。

2.2 VEGF的抗凋亡作用 脑对缺氧最敏感，缺氧时神经细胞受损，caspase-3被激活为有活性的酶，降解下游底物(如DNA修复酶、DNA依赖蛋白激酶、蛋白激酶C、Rb基因、DNA酶等)，使细胞凋亡事件完成且不可逆转。VEGF可以抑制脑内caspase-3的活化，从而抑制神经细胞凋亡。缺氧在诱导VEGF产生的同时也可诱导血红素加氧酶1的产生。VEGF与血红素加氧酶1间存在着正反馈效应。后者参与血红素的代谢，代谢产物包括CO、Fe2+和胆绿素等，其中Fe2+参与铁蛋白的合成，而铁蛋白和胆绿素是体内重要的抗氧化剂，对神经细胞起保护作用。VEGF可增加葡萄糖转运蛋白1的基因表达，并使细胞内的葡萄糖转运蛋白1转移到细胞膜的能力增强，加强葡萄糖的脑内转运，对抗缺氧缺血后脑内能量的衰竭而对抗凋亡。

2.3 对胶质细胞的作用 VEGF可促进培养的星形胶质细胞有丝分裂，刺激Schwann细胞增生和延长其成活时间。Wang等［3］在采用侧脑室注入的方式给予大鼠大脑中动脉阻断模型外源性VEGF的研究中发现，VEGF可刺激神经元、神经胶质细胞的生长、存活和轴突生长。

2.4 VEGF对神经发生的促进作用 Palmer等［4］在成年海马神经的实验研究中观察到大脑再生的神经元主要在血管周围，提示VEGF的促神经再生作用。Horie等［5］在研究不同氧气浓度对小鼠神经干细胞体外增殖和分化实验中证明缺氧可促进神经干细胞的增殖及分化，且与VEGF表达有关。缺氧导致神经胶质细胞VEGF的表达增加并诱导神经祖细胞迁移，VEGF表达上调与神经祖细胞迁移呈正相关。

3 VEGF治疗缺氧缺血脑损伤的给药方法

3.1 VEGF与血-脑脊液屏障 VEGF具有很强的增强微血管通透性的作用，特别是毛细血管后微静脉和小静脉。血-脑脊液屏障在大脑微环境的稳定中起重要作用。缺氧可导致血-脑脊液屏障通透性增加，并直接与VEGF表达上调有关［6］。在缺血和有炎症时VEGF可通过改变血-脑脊液屏障的紧密连接提高其通透性［7-8］。Kilic等［9］观察到磷脂酰肌醇3激酶/Akt途径介导VEGF在局灶性脑缺血后血-脑脊液屏障通透性发生改变，发现VEGF的神经保护作用常伴随血-脑脊液屏障通透性的增加，这就限制了VEGF神经保护作用在临床上的应用。如何发挥药物的神经保护作用又减少血-脑脊液屏障通透性增加带来的不良反应具有重要意义。

3.2 给药途径及剂量

3.2.1 给药途径 研究发现在缺氧缺血后一次性低剂量向脑室内输注VEGF不仅可发挥VEGF的神经保护作用，还可避免其增加血管通透性，提示选择适当的给药方式可以避免不良反应。注入脑室给药是有创操作，容易损伤大脑，导致颅内感染。Hayashi等［10］发现雄性Wistar大鼠局灶脑缺血后即静脉注射重组人血管内皮生长因子(rhVEGF165)后，局灶脑缺血的半暗带区血管生成增多，在缺血早期应用rhVEGF165增加了血-脑脊液屏障渗漏和出血倾向，加重了缺血损伤，结果提示，在急性期应用VEGF会增加出血转化的风险，VEGF的半衰期很短，静脉给药需要持续给药，而VEGF价格昂贵，临床应用会给患者很大的经济压力。De Rosa等［11］在经鼻腔给予抗神经生长因子转基因小鼠神经生长因子实验研究中，观察到一些大分子蛋白物质经鼻腔给药后在嗅球高浓度聚集而血药浓度并无明显升高的现象，提示嗅黏膜与大脑之间存在一条绕过血-脑脊液屏障的直接通路。该通路的存在为VEGF提供了直接进入中枢神经的无创给药途径，也为中枢神经系统获得显著提高的药物浓度和药效提供了极大的方便。

3.2.2 给药剂量 Yasuhara等［12］研究显示，经大脑纹状体途径补充VEGF时对多巴胺能神经元有保护作用，1 μg/L VEGF的保护作用强于100 μg/L的保护作用，且高剂量VEGF还可导致脑水肿。此外，较大剂量的VEGF不仅可导致血-脑脊液屏障破坏，还可导致黑质多巴胺能神经元退变。杨冀萍等［13］发现在大鼠MCAO模型中经鼻给予VEGF 100 mg/L(300 μL)不能减少梗死体积，促进神经功能恢复，也不能诱导血管发生;而给予VEGF 200 mg/L(300 μL)既可以降低梗死体积，又可以促进神经功能修复以及诱导血管生成;但500 mg/L(300 μL)可以诱导血管生成，却不能减少梗死体积和促进神经功能修复。因此，应使用合适剂量，在充分发挥VEGF神经保护功效的同时，避免带来的负面影响，这一剂量还需实验研究不断探索。

3.3 VEGF的转基因治疗

3.3.1 基因载体 VEGF蛋白不仅难以透过血-脑脊液屏障而且半衰期很短，在循环中很快降解。转基因治疗法可以突破血-脑脊液屏障的限制，并产生稳定的VEGF蛋白表达，产生长期稳定的疗效。关键是选择基因载体，理想的载体应该具备如下特性:①较高的浓度(病毒数＞104/L);可以感染多种细胞。②方便制备并且能够复制。③可以整合进入宿主的特定染色体位点或保持稳定的游离基因。④具有与调控元件相应的转录单元。⑤能靶向感染目标细胞。⑥无免疫原性。腺病毒系统安全、遗传毒性低、感染率高、易繁殖、宿主广泛，其并不整合到宿主细胞，不会产生严重的不良反应［14-16］。Bellomo 等［17］分别构建了表达LacZ标示基因的重组腺病毒(rAAV-LacZ)和VEGF165cDNA的重组腺病毒(rAAV-VEGE165)载体，立体定向注射到沙土鼠左侧脑室，6、12 d后将这些动物手术制做脑缺血/再灌注模型，分别评价脑水肿、CA1区的迟发性神经元死亡等指标，结果发现以rAAV-VEGE165处理的沙土鼠丘脑及皮质区免疫组化有明显的VEGF阳性染色，沙土鼠在脑缺血/再灌注后24 h的生存率明显高于rAAV-LacZ处理组，同时其脑组织含水量亦明显减少，说明可显著减轻脑梗死后的脑水肿程度，组织学观察证实海马CA1区的神经元死亡数量显著少于rAAV-LacZ处理组。Zheng等［16］将腺病毒介导的VEGF165转导至缺氧缺血性脑损伤7 d龄SD大鼠脑组织中，发现腺病毒介导的VEGF165能诱导脑组织的神经细胞和血管内皮细胞表达VEGF蛋白，其机制可能是通过调节抗凋亡基因及促凋亡基因表达有关的分子机制对缺氧缺血/再灌注后脑损伤发挥保护治疗作用。腺病毒系统的缺点是免疫原性，基因表达时间短暂，基因容量小。慢病毒载体可感染各种细胞整合人基因组，持续表达，免疫原性低。基因容量小，有致基因突变的可能。纳米颗粒作为载体性质稳定，易于制备，可较长时间持续表达，无免疫原性，缺点是易受体内玻璃质等物理化学屏障影响［18］。

3.3.2 联合其他基因治疗 赵英杰等［19］在成年雄性Wistar大鼠脑缺血模型上联合应用外源性VEGF165和促血管生成素1基因治疗，发现外源性VEGF165和促血管生成素1基因合用可以保护脑细胞，促进新生血管生成，减轻脑水肿，改善大鼠脑神经功能。热休克蛋白表达都有不同程度的上调及减轻缺血后的神经元损伤。已在脑缺血动物模型验证了转基因技术外源性过度表达热休克蛋白的神经保护作用［20］。通过转基因技术在缺血组织导入多种抗氧化酶基因虽可保护缺血缺氧后的神经元，但转基因的安全性有待确定［21］。

3.4 给药时间窗 缺氧缺血性脑病治疗的“时间窗”一直是临床医师及科学研究者共同关心的问题。对于缺氧缺血性脑损伤后不同阶段的认识有助于了解缺氧缺血性脑病治疗的“时间窗”。缺氧缺血性损伤后组织细胞能量及代谢变化分为两个阶段:原发性细胞损伤阶段和迟发性细胞损伤阶段——继发性能量衰竭。二次能量衰竭之间的潜伏期亦就是所谓的治疗“时间窗”，是减轻脑损伤的神经保护措施能被成功应用的最佳时期。此间期在动物模型为6～15 h，在人类新生儿中可能更短(6 h左右)。

4 结语

目前，人们逐步认识到VEGF在缺氧缺血脑病中的重要作用。目前对VEGF的研究主要集中在啮齿类动物模型上，VEGF对中枢神经系统的一切活性作用在动物模型上已经得到广泛证实，临床治疗上尚缺乏更全面的临床证据的支持。因此，VEGF真正能在新生儿缺血缺氧脑病中应用还存在用药的安全剂量和安全有效的给药方法等很多具体的问题。

［1］ Senger DR，Galli SJ，Dvorak AM，et al.Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid［J］.Science，1983，219(4587):983-985.

［2］ Gustavsson M，Mallard C，Vannucci SJ，et al.Vascular response to hypoxic preconditioning in the immature brain［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(5):928-938.

［3］ Wang YQ，Cui HR，Yang SZ，et al.VEGF enhance cortical newborn neurons and their neurite development in adult rat brain after cerebral ischemia［J］.Neurochem Int，2009，55(7):629-636.

［4］ Palmer TD，Willhoite AR，Gage FH.Vascular niche for adult hippocampal neurogenesis［J］.J Comp Neurol，2000，425(4):479-494.

［5］ Horie N，So K，Moriya T，et al.Effects of oxygen concentration on the proliferation and differentiation of mouse neural stem cells in vitro［J］.Cell Mol Neurobiol，2008 28(6):833-845.

［6］ Kaur C，Ling EA.Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions［J］.Curr Neurovasc Res，2008，5(1):71-81.

［7］ Yeh WL，Lu DY，Lin CJ，et al.Inhibition of hypoxia-induced increase of blood-brain barrier permeability by YC-1 through the antagonism of HIF-1alpha accumulation and VEGF expression［J］.Mol Pharmacol，2007，72(2):440-449.

［8］ Argaw AT，Gurfein BT，Zhang Y，et al.VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(6):1977-1982

［9］ Kilic E，Kilic U，Wang Y，et al.The phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway mediates VEGF's neuroprotective activity and induces blood brain barrier permeability after focal cerebral ischemia［J］.Faseb，2006，20(8):1185-1187.

［10］ Hayashi T，Abe K，Itoyama Y.Reduction of ischemic damage by application of vascular endothelial growth factor in rat brain after transient ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1998，18(8):887-895.

［11］ De Rosa R，Garcia AA，Braschi C，et al.Intranasal administration of nerve growth factor(NGF)rescues recognition memory deficits in AD11 anti-NGF transegenic mice［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(10):3811-3816.

［12］ Yasuhara T，Shingo T，Muraoka K，et al.The differences between high and low-dose administration of VEGF to dopaminergic neurons of in vitro and in vivo Parkinson's disease model［J］.Brain Res，2005，1038(1):1-10.

［13］ 杨冀萍，王兆露，程曦，等.经鼻给予VEGF治疗脑缺血/再灌注大鼠的量效关系［J］.脑与神经疾病杂志，2009，17(9):329-331.

［14］ Sharma A，Tandon M，Babgari DS，et al.Adenoviral vector-based strategies for cancer therapy［J］.Curr Drug Ther，2009，4(2):117-138.

［15］ Hogg RT，Garcia JA，Gerard RD.Adenoviral targeting of gene expression to tumors［J］.Cancer Gene Ther，2010，17(6):375-386.

［16］ Zheng XR，Zhang SS，Yang YJ，et al.Adenoviral vector-mediated transduction of VEGF improves neural functional recovery after hypoxia-ischemic brain damage in neonatal rats［J］.Brain Res Bull，2010，81(4/5):372-377.

［17］ Bellomo M，Adamo EB，Deodato B，et al.Enhancement of expression of vascular endothelial growth factor after adeno-associated virus gene transfer is associated with improvement of brain ischemia injury in the gerbil［J］.Pharmacol Res，2003，48(3):309-317.

［18］ Yuan Y，Tan J，Wang Y，et al.Chitosan nanoparticles as non-viral gene delivery vehicles based on atomic force microscopy study［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2009，41(6):515-526.

［19］ 赵英杰，李照建，王任直，等.rAAV1载体介导外源性VEGF-165和Angiopoietin-1基因治疗大鼠脑缺血的疗效评价及其机制研究［J］.科技导报，2009，27(21):39-49.

［20］ van der Weerd L，Tariq Akbar M，Aron Badin R，et al.Overexpression of heat shock protein 27 reduces cortical damage after cerebral ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2010，30(4):849-856.

［21］ Jin G，Arai K，Murata Y，et al.Protecting against cerebrovascular injury:contributions of 12/15-lipoxygenase to edema formation after transient focal ischemia［J］.Stroke，2008，39(9):2538-2543.