促凋亡基因puma与肿瘤治疗

王明立(综述)，段 勇，王玉明(审校)

(昆明医学院第一附属医院检验科，昆明 650032)

自20世纪70年代以来，我国的恶性肿瘤发病率及病死率一直呈上升的趋势，癌症已成为中国城市和农村居民的第一位死因。肿瘤的发生、发展涉及癌基因的激活及抑癌基因的失活，同时与凋亡失衡也密切相关。近年来研究表明，凋亡相关基因的改变与恶性肿瘤的发生、发展及预后有一定关系［1］。puma是2001年新发现的一种促凋亡基因，是Bcl-2家族BH3-only亚家族成员，可依赖和不依赖p53快速诱导凋亡［2-4］。puma的表达及作用与肿瘤发生密切相关，外源性导入puma基因可诱导肿瘤细胞的凋亡并提升放疗和化疗的效果。

1 puma的结构和功能

2001 年，三个科研小组［2，5-6］相继发现了 puma基因。人puma基因定位于19q，cDNA长1.9 kb，富含GC序列。该基因包含4个外显子(1a或1b、2、3、4，其中外显子2含假定的转录起始密码子，外显子3中含编码BH3的序列)和3个内含子，转录后形成4种不同剪接体(puma-α、-β、-γ 和-δ，其中 puma-α 和puma-β含有 BH3结构域，具有诱导凋亡的功能［5，7］)。puma的转录起始位点上游存在两个 p53结合位点BS1和BS2，p53与BS2结合后可显著促进 puma的转录［2，5］。puma 编码 193 个氨基酸的蛋白，借助C端43个氨基酸残基定位于线粒体并诱导凋亡。

puma在生理状态下表达量较低，但当机体受到刺激后在细胞凋亡早期就可表达，并通过多种途径加速细胞凋亡。puma可通过p53依赖途径和p53非依赖途径诱导凋亡，由射线照射、DNA损伤药物、缺氧和一氧化氮等引起的细胞凋亡作用是通过p53依赖途径实现的［8-9］，而血清饥饿、缺血/再灌注、细胞因子撤除等刺激则诱导p53非依赖的凋亡途径［10-12］。

2 puma在癌组织中的表达和作用

puma基因在人体各种癌组织中的表达不一。Jansson等［13］对散发大肠癌的研究显示，puma mRNA和蛋白在肿瘤组织的表达与正常黏膜组织相比存在上调和下调。王玉明等［14］对非小细胞肺癌的研究表明，puma mRNA和蛋白在癌组织、癌旁、远癌及肺良性病变组织中的表达差异无统计学意义。Karst等［15］对原发性、转移性黑色素瘤及恶变痣的研究发现，puma表达在各组间存在差异且与恶性程度呈负相关;免疫组织化学的方法也显示，puma在喉鳞状细胞癌及胰腺导管腺癌中的表达低于癌旁组织。puma在多种癌组织中低表达，有研究报道［16］，剔除puma可增强氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)诱导的小鼠结肠癌的形成，表明puma有抑制肿瘤生成的作用。

3 puma与肿瘤治疗

肿瘤是由细胞异常增殖、分化停滞以及细胞凋亡失衡所致。选择性诱导肿瘤细胞的凋亡并同时减少正常组织细胞的凋亡，是肿瘤治疗学研究的热点。在肿瘤的治疗中，选择性的增加促凋亡基因的活性，可以增加放化疗的效果，并减少其不良反应。

3.1 puma与基因治疗 通过载体向肿瘤细胞靶向导入puma基因或剔除/剔低对puma有抑制作用的基因，诱导肿瘤细胞的凋亡，可能是一种可行并有效的治疗方法。张宇雯等［17］利用脂质体将携带puma cDNA的表达载体导入体外培养的胃癌SGC-7901细胞，发现转染puma后癌细胞的增殖能力明显低于转染空载体组和阴性对照组，而细胞凋亡的比例却明显高于这两组。张克君等［18］用不同感染指数的携带puma的重组腺病毒载体(ad-puma)转染人胰腺癌细胞株AsPC-1的研究发现，随着感染滴度的增加，细胞内puma表达逐渐增加，且随puma表达上调胰腺癌细胞的生长抑制增加。裸鼠移植瘤试验发现，ad-puma转染可抑制肿瘤生长。Yeh等［19］采用聚乙烯亚胺介导puma基因导入原位口腔癌SAS细胞发现，puma在体外和裸鼠移植瘤体内经线粒体途径诱导凋亡，且可使移植瘤生长受抑，并延长患病小鼠的生存期。

研究报道，S1ug是puma的强烈抑制基因，Zhang等［20］采用Slug siRNA沉默胆管癌细胞的S1ug基因后，S1ug被抑制同时puma表达上调，细胞凋亡率明显提高，裸鼠移植瘤生长受抑。近年发现，部分miRNAs以puma为靶基因并抑制其表达。在EB病毒感染所致的鼻咽癌中miR-BART5高表达而puma低表达，对含EB病毒的鼻咽癌细胞系C666-1抑制miR-BART5后则诱导凋亡［21］。miR-221/222靶作用于 puma抑制人胶质瘤细胞的凋亡，剔除miR-221/222后puma表达和细胞凋亡增高、移植瘤生长减慢［22］。

3.2 puma与放射和化学治疗 放疗和化疗是临床治疗癌症的常规方法，癌细胞出现放、化疗耐受是影响疗效的主要原因之一，而某些癌细胞对放、化疗耐受与癌细胞丧失凋亡能力有关［23］。

2006年，Yu等［24］用 ad-puma转染肺癌 A549细胞，并分别同时给以γ线照射和化疗药物(紫杉醇、氟尿嘧啶、奥沙利铂、顺铂、依托泊苷和阿霉素)处理，结果显示puma通过诱导凋亡显著增强肺癌细胞对放射治疗和化疗药物的敏感性，且puma在此的增敏作用与p53的存在状态无关。2007年，Chen等［25］在体外和裸鼠体内对耐药绒癌jeg-3/vp16细胞的研究表明，ad-puma导入可加强抗癌药物诱导的凋亡，并可恢复药物抵抗绒毛膜癌细胞对化疗药物(氟尿嘧啶，依托泊苷或甲氨蝶呤)的敏感性。同年，Sun等［26］对头颈鳞癌的研究发现，puma活性缺失可促使产生化学抵抗，而导入ad-puma后可使头颈鳞癌细胞对顺铂敏感。

2009年，朱东明等［27］对胰腺癌PANC-1细胞及其移植瘤分别进行转染puma、射线照射和联合转染照射的处理后发现，联合处理组细胞生长抑制率和凋亡率明显高于单纯转染组和单纯照射组，而移植瘤平均生长速率明显低于这两组。2010年，Zhang等［28］对胆管癌QBC939细胞的分析显示，放射处理可以上调puma的表达及增加细胞凋亡，剔除puma抑制基因后再行放射处理凋亡更加明显，移植瘤生长明显受抑。

2011年，Jung等［29］对肾癌 Caki细胞的研究表明，褪黑素和咖啡豆醇同时处理细胞可以上调puma，此上调作用与p53的状态无关，由内质网应急相关蛋白CHOP介导;而Caki细胞通过siRNA剔除puma后，褪黑素和咖啡豆醇引起的细胞凋亡受到抑制。

3.3 puma与其他基因、因子等的联合治疗 近年来研究表明，某些因子可上调或抑制puma的表达。Gao等［30］研究发现，干扰素调节因子 1(interferon regulatory factor-1，IRF-1)通过上调puma经线粒体途径诱导凋亡，在puma剔除和剔低的细胞IRF-1诱导的凋亡明显减低，并首次证实了puma是IRF-1的调节基因及干扰素γ可不依赖p53诱导puma的表达。Nathan等［31］的研究显示剔除，CCCTC 结合因子(CTCF)可使puma表达明显增高，这一过程没有p53及其他p53靶基因的激活。

针对癌基因Mdm2与p53间相互作用的小分子抑制剂的应用是肿瘤治疗的一个重要方向。Mdm2的抑制剂Nutlin-3通过与Mdm2结合，抑制Mdm2和p53的相互作用，从而激活p53，诱导细胞凋亡，并发挥抗肿瘤作用。近年又有研究发现，在缺乏p53的人结肠癌Caco2细胞，Nutlin-3介导的Mdm2降解引起p73的积聚，继而诱导puma的表达［32］。

4 puma与细胞保护

外源性导入puma基因增加puma表达，可有效抑制肿瘤细胞的生长，增强肿瘤放化疗的效果，但同时也增加了正常细胞的凋亡，如何增加puma基因的靶向性及保护正常细胞免受损伤已成为目前面临的主要问题。骨髓损伤是肿瘤放化疗的主要不良反应之一。Yu等［33］的研究发现，在高剂量放射处理时puma缺失可保护造血干细胞并延长其存活时间。Shao等［34］的研究也得出类似结论，并发现这种保护作用强弱与puma缺失的基因量有关。通过其他因子抑制puma基因是降低puma表达的一种可行途径，Qiu等［35］的研究表明，生长因子通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/p53的轴向作用抑制puma表达，并抑制放射引起的肠干细胞的凋亡。Inoue等［36］研究发现，白细胞介素15通过减少促凋亡基因Bim和puma的表达抑制免疫细胞凋亡。此外，Mustata等［37］的研究也表明，开发及应用 puma的小分子抑制剂可能是降低puma表达及减少放射引起细胞死亡的安全有效的方法。

5 问题与展望

大量研究已表明，puma在多种癌组织中呈低表达，外源性导入puma或剔除其抑制基因增高puma的表达均可诱导肿瘤细胞的凋亡，且puma与放疗、化疗剂同时使用会提升放化疗的效果。但如何提高puma在肿瘤治疗中的靶向性及降低转染载体的毒性，在特异性增高puma在肿瘤细胞表达的同时不增高正常细胞的puma表达，降低放化疗对正常细胞的损伤，仍然是puma下一步研究的重点。尽管目前puma基因用于治疗肿瘤还未能从实验室走向临床，但随着puma功能研究的不断深入，相信puma基因的应用能很快为肿瘤的治疗和预防提供新的有效的方法。

［1］ 杨银峰，李家林.细胞相关凋亡基因与人类肿瘤［J］.生命的化学，2004，24(3):270-273.

［2］ Yu J，Zhang L，Hwang PM，et al.PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells［J］.Mol Cell，2001，7(3):673-682.

［3］ Yu J，Zhang L.No PUMA，no death:implications for p53-dependent apoptosis［J］.Cancer Cell，2003，4(4):248-249.

［4］ Jeffers JR，Parganas E，Lee Y，et al.Puma is an essential mediator of p53-dependent and p53-independent apoptotic pathways［J］.Cancer Cell，2003，4(4):321-328.

［5］ Nakano K，Vousden KH.PUMA，a novel proapoptotic gene，is induced by p53［J］.Mol Cell，2001，7(3):683-694.

［6］ Han JW，Flemington C，Houghton AB，et al.Expression of bbc，a proapoptotic BH-2 only gene，is regulated by diverse cell death and survival signals［J］.PNAS，2001，98(20):11318-11323.

［7］ Yu J，Wang Z，Kinzler KW，et al.PUMA mediates the apop totic response to p53 in colorectal cancer cells［J］.PNAS，2003，100(4):1931-1936.

［8］ Avila JL，Grundmann O，Burd R，et al.Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2009，73(2):523-529.

［9］ Niizuma K，Endo H，Nito C，et al.Potential role of PUMA in delayed death of hippocampal CA1 neurons after transient global cerebral ischemia［J］.Stroke，2009，40(2):618-625.

［10］ Ming L，Sakaida T，Yue W，et al.Sp1 and p73 activate PUMA following serum starvation［J］.Carcinogenesis，2008，29(10):1878-1884.

［11］ Li YZ，Liu XH，Rong F.PUMA mediates the apoptotic signal of hypoxia/reoxygenation in cardiomyocyte through mitochondrial pathway［J］.Shock，2011，36(6):579-584.

［12］ Ekoff M，Kaufmann T，Engstrom M，et al.The BH3-only protein Puma plays an essential role in cytokine deprivation induced apoptosis of mast cells［J］.Blood，2007，110(9):3209-3217.

［13］ Jansson A，Arbman G，Sun XF，et al.mRNA and protein expression of puma in sporadic colorectal cancer［J］.Qncol Rep，2004，12(6):1245-1249.

［14］ 王玉明，金克炜，李娅，等.非小细胞肺癌中puma基因外显子突变和mRNA表达的分析［J］.中华病理学杂志，2009，38(2):121-122.

［15］ Karst AM，Dai DL，Martinka M，et al.PUMA expression is significantly reduced in human cutaneous melanomas［J］.Oncogene，2005，24(6):1111-1116.

［16］ Qiu W，Carson-Walter EB，Kuan FS，et al.PUMA suppresses intestinal tumorigenesis in mice［J］.Cancer Res，2009，69(12):4999-5006.

［17］ 张宇雯，刘兴汉，马洪星，等.Puma基因转染对胃癌SGC-7901细胞的促凋亡作用及机制［J］.中国肿瘤，2008，17(2):137-141.

［18］ 张克君，李德春，崔海宁.p53正向凋亡调节因子重组腺病毒载体的构建及对胰腺癌细胞增殖的抑制作用［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2009，29(1):65-70.

［19］ Yeh CC，Hsieh HL，Lee J，et al.Polyethylenimine-mediated PUMA gene delivery to orthotopic oral cancer:suppression of tumor growth through apoptosis induction in situ and prolonged survival［J］.Head Neck，2011，33(6):878-885.

［20］ Zhang KJ，Chen D，Wang XG，et al.RNA interference targeting slug increases cholangiocarcinoma cell sensitivity to cisplatin via upregulating PUMA［J］.Int J Mol Sci，2011，12(1):385-400.

［21］ Choy EY，Siu KL，Kok KH，et al.An Epstein-Barr virus-encoded microRNA targets PUMA to promote host cell survival［J］.J Exp Med，2008，205(11):2551-2560.

［22］ Zhang CZ，Zhang JX，Zhang AL，et al.MiR-221 and miR-222 target PUMA to induce cell survival in glioblastoma［J］.Molecular Cancer，2010，9:229.

［23］ La Porta CA.Drug resistance in melanoma:new perspectivm.Curt Med Chem，2007，14(4):387-391.

［24］ Yu J，Yue W，Wu B，et al.PUMA sensitizes lung cancer cells to chemotherapeutic agents and irradiation［J］.Clin Cancer Res，2006，12(9):2928-2936.

［25］ Chen Y，Qian HL，Wang HJ，et al.Ad-PUMA sensitizes drug-resistant choriocarcinoma cells to chemotherapeutic agents［J］.Gynecol Oncol，2007，107(3):505-512.

［26］ Sun QH，Sakaida T，Yue W，et al.Chemosensitization of head and neck cancer cells by PUMA［J］.Mol Cancer Ther，2007，6(12):3180-3188.

［27］ 朱东明，张克君，李德春，等.重组腺病毒介导PUMA基因对胰腺癌细胞的放射增敏作用［J］.中华放射医学与防护杂志，2009，29(1):27-30.

［28］ Zhang KJ，Zhang BY，Lu Y，et al.Slug inhibition upregulates radiation-induced PUMA activity leading to apoptosis in cholangiocarcinomas［J］.Med Oncol，2011，28(Suppl 1):S301-S309.

［29］ Um HJ，Park JW，Kwon TK.Melatonin sensitizes Caki renal cancer cells to kahweol-induced apoptosis through CHOP-mediated upregulation of PUMA［J］.J Pineal Res，2011，50(4):359-366.

［30］ Gao J，Senthil M，Ren B，et al.IRF-1 transcriptionally upregulates PUMA，which mediates the mitochondrial apoptotic pathway in IRF-1-induced apoptosis in cancer cells［J］.Cell Death Differ，2010，17(4):699-709.

［31］ Gomes NP，Espinosa JM.Gene-specific repression of the p53 target gene PUMA via intragenic CTCF-cohesin binding［J］.Genes Dev，2010，24(10):1022-1034.

［32］ Ray RM，Bhattacharya S，Johnson LR.Mdm2 inhibition induces apoptosis in p53 deficient human colon cancer cells by activating p73-and E2F1-mediated expression of PUMA and Siva-1［J］.Apoptosis，2011，16(1):35-44.

［33］ Yu H，Shen HM，Yuan YZ，et al.Deletion of Puma protects hematopoietic stem cells and confers long-term survival in response to highdose gamma-irradiation［J］.Blood，2010，115(17):3472-3480.

［34］ Shao LJ，Sun Y，Zhang ZH，et al.Deletion of proapoptotic Puma selectively protects hematopoietic stem and progenitor cells against high-dose radiation［J］.Blood，2010，115(23):4707-4714.

［35］ Qiu W，Leibowitz B，Zhang L，et al.Growth factors protect intestinal stem cells from radiation-induced apoptosis by suppressing PUMA through the PI3K/AKT/p53 axis［J］.Oncogene，2010，29(11):1622-1632.

［36］ Inoue S，Unsinger J，Davis CG，et al.IL-15 prevents apoptosis，reverses innate and adaptive immune dysfunction，and improves survival in sepsis［J］.J Immunol，2010，184(3):1401-1409.

［37］ Mustata G，Li M，Zevola N，et al.Development of small-molecule PUMA inhibitors for mitigating radiation-induced cell death［J］.Curr Topics Med Chem，2011，11(3):281-290.