用苎麻生物脱胶废水生产热带假丝酵母单细胞蛋白

王 军，郝新艳，殷朝敏，蔡 荫 ，曾庆福，阮新潮

（1. 武汉纺织大学 纺织印染清洁生产教育部工程研究中心，湖北 武汉 430073；2. 武汉纺织大学 环境工程学院，湖北 武汉 430073）

用苎麻生物脱胶废水生产热带假丝酵母单细胞蛋白

王 军1，郝新艳1，殷朝敏2，蔡 荫2，曾庆福1，阮新潮1

（1. 武汉纺织大学 纺织印染清洁生产教育部工程研究中心，湖北 武汉 430073；2. 武汉纺织大学 环境工程学院，湖北 武汉 430073）

采用热带假丝酵母处理苎麻生物脱胶废水。将COD为23 060 mg/L的苎麻生物脱胶废水稀释1倍后进行发酵处理，COD去除率最高，为60.85%。发酵条件的正交实验结果表明：在发酵温度为35 ℃、初始发酵pH为7.0、接种量为 10%、发酵时间为48 h的条件下，苎麻生物脱胶废水COD去除率最高；发酵温度为30 ℃、初始发酵pH为7.0、接种量为 10%、发酵时间为48 h的条件下，单细胞蛋白生成量最高。发酵时间为48 h时，灭菌的发酵培养基的COD去除率为75.75%，单细胞蛋白生成量为5.375 g/L；未灭菌的发酵培养基的COD去除率为72.25%，单细胞蛋白生成量为2.875 g/L。

热带假丝酵母；苎麻；生物脱胶；发酵；单细胞蛋白；废水处理

苎麻纤维是我国重要的纺织原料之一。苎麻的主要化学组成是纤维素，质量分数为65%～70%，其余为半纤维素、果胶、木质素、水溶物、蜡脂质、灰分等［1］，统称为苎麻胶质。苎麻胶质影响纤维的可纺性［2］，必须从苎麻中脱除。苎麻脱胶有化学脱胶和生物脱胶两种方法。化学脱胶成本高，对环境污染严重［3-4］。生物脱胶具有可提高精干麻质量、不损伤纤维、无污染等优点［5］，是苎麻脱胶技术的主要发展方向。苎麻经生物菌液或酶液脱胶处理后，苎麻胶质被降解成小分子多糖［5］，所以苎麻生物脱胶废水属于高浓度有机废水，可生化性较强［6］。

热带假丝酵母（Candida tropicalis）体内含有氧化分解酶，能降解可生化性较好的有机废水，并同时获得酵母蛋白，既消除了环境污染，又可使有机废水得到综合利用。目前热带假丝酵母已成功用于食品、造纸等工业废水的处理［7-8］。

本工作利用热带假丝酵母处理苎麻生物脱胶废水，同时生产单细胞蛋白，对苎麻生物脱胶废水进行了综合利用。

1 实验部分

1.1 材料、试剂和仪器

未稀释的初始苎麻生物脱胶废水COD为23 060 mg/L。热带假丝酵母筛选自湖北天化麻业股份有限公司脱胶厂沤麻池的沤麻液。苎麻生物脱胶废水取自武汉纺织大学环境科学研究所，经脱胶微生态菌群［9］处理。所用试剂均为分析纯。

保藏培养基［10］：酵母膏2.0 g，蛋白胨3.0 g，琼脂粉 20 g，葡萄糖10 g，定容至1.0 L，121℃灭菌20 min。

种子液培养基：葡萄糖 10 g，牛肉膏 5 g，酵母粉5 g，蛋白胨20 g，氯化钠5 g，定容至 1.0 L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 m in。

发酵培养基：在250 m L三角瓶中装入 l00 m L适当稀释的苎麻生物脱胶废水，加入一定量质量分数为0.3% 的（NH4）2HPO4溶液调节废水pH，121 ℃灭菌20 min。

THZ-D型恒温摇床：太仓试验设备厂。

1.2 菌种鉴定

抽提菌种基因组总DNA，用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和引物NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）通过聚合酶链式反应（PCR ）扩增其26s rDNA［11］。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后克隆到pMD18-T载体， 送北京三博远志公司对26s rDNA基因序列进行测序。在 GenBank 的序列局部相似性查询系统（BLAST）内进行比对，对所得菌种进行鉴别。

1.3 实验方法

1.3.1 种子液的培养

用接种环将斜面上生长的菌种接入到装有 50 m L种子液培养基的250 m L三角瓶内，置于恒温摇床中振荡培养24～48 h，备用。

1.3.2 苎麻生物脱胶废水的发酵处理

将种子液按一定的接种量（体积分数，下同）接入到不同初始COD的发酵培养基中，置于180 r/m in恒温摇床上在一定温度条件下发酵一定时间后测定其COD。

取一定量发酵后废水，4 000 r/m in离心10 m in，去除上清液，剩余菌体用去离子水洗涤后，在 105 ℃烘箱中烘干至恒重，称量菌体质量，计算单细胞蛋白生成量（单位体积废水中单细胞蛋白的质量，g/L）。

1.3.3 发酵培养基灭菌处理和未灭菌处理的效果对比

分别在经过煮沸灭菌处理和未经灭菌处理的发酵培养基中接入种子液，在发酵温度为35 ℃、初始发酵pH为7.0、接种量为 10%的条件下，连续发酵24 h后取样测量废水中COD和单细胞蛋白生成量，然后每隔6 h取样分析，直至发酵时间达到48 h。比较发酵培养基灭菌和不灭菌情况下的COD去除率和单细胞蛋白生成量。

1.4 分析方法

采用重铬酸钾法测定废水COD［12］。

2 结果与讨论

2.1 菌种的鉴定

测序获得菌种的26 s rDNAD1/D2区段序列如下，与热带假丝酵母菌的序列相似度达98%，因此该菌种鉴定为热带假丝酵母菌［13］。

2.2 初始废水COD对COD去除率的影响

初始废水COD对COD去除率的影响见表1。

表1 初始废水COD对COD去除率的影响

由表1可见，初始废水COD为11 530 mg/L时，COD去除率最高，为60.85%，故将苎麻生物脱胶废水稀释1倍后进行发酵处理，COD去除效果最佳。这是因为苎麻生物脱胶废水中含有大量单糖、多糖等有机分子，其浓度过低时没有足够的底物用于菌体生长；其浓度过高时，高浓度有机分子与抑制物的有害作用及其造成的渗透压胁迫共同导致菌体生长受到抑制。

2.3 发酵条件的正交实验结果

为优化发酵条件，设计了4因素3水平的正交实验L9（34）。 正交实验因素水平见表2，正交实验结果见表3。

表2 正交实验因素水平

表3 正交实验结果

正交实验结果表明，各因素对废水COD去除率的影响显著性由强到弱顺序依次为：A＞D＞B＞C，最优方案为A1D2B3C3，即发酵温度为35 ℃，初始发酵pH为7.0，接种量为 10%，发酵时间为48 h。

各因素对单细胞蛋白生成量的影响显著性由强到弱顺序依次为：B＞D＞C＞A，最优方案为B3D2C2A1，即发酵温度为30 ℃，初始发酵pH为7.0，接种量为 10%，发酵时间为48 h。

本研究中废水COD去除率最高和单细胞蛋白生成量最高的发酵条件仅有发酵温度存在差异。这可能是由于不同温度下菌体利用的有机物和体内的生理生化反应存在差异的原因，如COD的去除与三羧酸生成量有关系，而单细胞蛋白的产生与糖酵解途径有关［14］。

2.4 发酵培养基灭菌与否对废水处理效果的影响

发酵培养基灭菌与否对废水处理效果的影响见图1。由图1可见：发酵时间少于30 h时，未灭菌的发酵培养基比灭菌的发酵培养基的COD去除率高；发酵时间超过36 h后，灭菌的发酵培养基的COD去除率高于未灭菌的发酵培养基；发酵时间为48 h时，灭菌的发酵培养基的COD去除率为75.75%，未灭菌的发酵培养基的COD去除率为72.25%。这是因为未灭菌的发酵培养基中菌群组成复杂，热带假丝酵母虽然占有优势，但与其他菌种存在竞争，共同消耗废水中的有机小分子，因而在发酵反应的前30 h其COD去除率比灭菌的发酵培养基的COD去除率高。发酵反应超过30 h后，由于未灭菌的发酵培养基中部分种类的细菌生长速度减慢，而且部分菌体出现自溶现象，因而其COD去除率比灭菌的发酵培养基的COD去除率低。

由图1还可见，发酵时间为48 h时，灭菌发酵培养基的单细胞蛋白生成量为5.375 g/L，未灭菌发酵培养基的单细胞蛋白生成量为2.875 g/L。这是因为灭菌发酵培养基中菌种单一，有利于热带假丝酵母的生长，故单细胞蛋白生成量较高。

图1 发酵培养基灭菌与否对废水处理效果的影响

3 结论

a）采用热带假丝酵母处理苎麻生物脱胶废水，将COD为23 060 mg/L的苎麻生物脱胶废水稀释1倍后进行发酵处理，COD去除率最高，为60.85%；

b）发酵条件的正交实验结果表明：发酵温度为35 ℃、初始发酵pH为7.0、接种量为 10%、发酵时间为48 h的条件下，废水COD去除率最高；发酵温度为30 ℃、初始发酵pH为7.0、接种量为 10%、发酵时间为48 h的条件下，单细胞蛋白生成量最高。

c）发酵时间少于30 h时，未灭菌的发酵培养基比灭菌的发酵培养基的COD去除率高；发酵时间超过36 h后，灭菌的发酵培养基的COD去除率高于未灭菌的发酵培养基。发酵时间为48 h时，灭菌的发酵培养基的COD去除率为75.75%，单细胞蛋白生成量为5.375 g/L；未灭菌的发酵培养基的COD去除率为72.25%，单细胞蛋白生成量为2.875 g/L。

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Production of Single Cell Protein from Ram ie Bio-degumm ing Wastewater Using Candida tropicalis

Wang Jun1，Hao Xinyan1，Yin Chaomin2，Cai Yin2，Zeng Qingfu1，Ruan Xinchao1

（1. Engineering Research Center for Cleaner Production of Textile Dying and Printing Under M inistry of Education，Wuhan Textile University，Wuhan Hubei 430073，China；2. School of Environmental Engineering，Wuhan Textile University，Wuhan Hubei 430073， China）

Ram ie bio-degumm ing wastewater was treated using Candida tropicalis. The wastewater with 23 060 mg/L of COD was diluted by 2 folds and treated by fermentation with the highest COD removal rate of 60.85%. The results of orthogonal experiments show that：Under the conditions of fermentation temperature 35 ℃，initial fermentation pH 7.0，inoculum dosage 10% and fermentation time 48 h，the COD removal rate is the highest；Under the conditions of fermentation temperature 30 ℃，initial fermentation pH 7.0，inoculum dosage 10% and fermentation time 48 h，the yield of single cell protein is the highest. When the fermentation time is 48 h，the COD removal rate and single cell protein yield with the sterilized fermentation medium are 75.75% and 5.375 g/L respectively，however，those with the unsterilized fermentation medium are 72.25% and 2.875 g/L respectively.

Candida tropicalis；ram ie；bio-degumm ing；fermentation；single cell protein；wastewater treatment

X703

A

1006-1878（2012）03 - 0255 - 05

2011 - 10 - 23；

2012 - 01 - 29。

王军（1976—），男，山东省高唐县人，博士，副教授，主要从事苎麻清洁生产方面的研究。电话027 - 87611776 ，电邮 Junwang@w tu.edu.cn。联系人：阮新潮，电话 027 - 87611776 ，电邮 ruanxc72@163.com。

湖北省教育厅优秀中青年科技人才项目（Q20 081704）；国家科技支撑计划项目（2010BAD02B00）。

（编辑 祖国红）