原花青素对细胞损伤抑制的研究

葛昱彤，容婵，崔倩，徐莹莹，卜繁皓，封娟娟，何炎明

（中山大学生命科学学院，广东 广州 510275）

原花青素对细胞损伤抑制的研究

葛昱彤，容婵，崔倩，徐莹莹，卜繁皓，封娟娟，何炎明*

（中山大学生命科学学院，广东 广州 510275）

为了探究原花青素对细胞膜氧化受损的抑制作用以及浓度和抑制程度之间的关系。将兔血制成1%红细胞（RBC）悬液,制造H2O2氧化模型，再加入不同浓度的原花青素溶液，最后测定红细胞溶血量、膜的通透性、丙二醛（MDA）含量。随着原花青素浓度的增高，溶血百分比相应的增大。浓度为0.2 mg/L～0.4 mg/L的原花青素对脂质氧化抑制效果最明显。原花青素可以抑制细胞氧化损害，而且在一定范围内和原花青素的浓度呈正相关。

原花青素；细胞膜；氧化受损；MDA浓度；溶血量

大量的研究表明，无论在体内还是体外，过多的氧自由基可引发红细胞（RBC）膜脂质过氧化，导致RBC膜脂质、蛋白质和Hb的氧化损伤，继而引发RBC氧化溶血，是发生溶血性疾病的重要原因之一[1]。原花青素是一种已经引起广泛关注的保健食品，已经证实它能够消除酒精代谢过程中损害肝脏的氧化自由基而起到保护肝脏的作用。为了证实原花青素对细胞膜氧化损伤的抑制作用，探究原花青素浓度和抑制作用之间的关系，本文以H2O2为损伤因素，通过测定溶血程度和丙二醛含量等指标，进一步观察不同浓度的原花青素对H2O2诱导的兔RBC过氧化损伤的抑制作用[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜兔子血红细胞；原花青素：深圳市汉荣实业发展有限公司产品；MDA试剂盒：南京建成生物工程研究所；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 红细胞的分离

取新鲜抗凝静脉血，2000 r/min离心10 min，弃上清液，再用磷酸缓冲溶液（PBS，pH7.4）重复洗涤3次，严格控制转速为2000 r/min离心10 min。最后加入PBS液，配制成1%的红细胞悬液。

1.2.2 对照组及实验组的建立

对照组（CK）：取3 mL 1%红细胞悬液，然后将细胞悬液在37℃温浴5 min，再加入75 μl（血细胞悬液和H2O2，体积比为40:1）浓度为30%的H2O2进行氧化处理30 min。

实验组：设7个平行试验组，每组取3毫升1%红细胞悬液，先往血红细胞悬浮液中加入预先配好浓度为 0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mg/L 的原花青素溶液300 μl（血细胞悬液和原花青素体积比为10:1），37℃温浴30min后，再加入75μlH2O2进行氧化处理30min。

1.2.3 溶血百分比的测定

每个平行组取反应混合液2 mL，分两个试管，每个试管1 mL，分别加入2 mL的0.85%生理盐水和蒸馏水，2000 r/min离心10 min，离心后在540 nm处测其吸光值A、B，按公式（A/B）×100计算百分溶血度。

1.2.4 丙二醛（MDA）含量的测定

取1 mL反应混合液，按南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定方法测其MDA含量。

1.2.5 根据高铁血红蛋白的含量测定细胞膜通透性

从每个平行实验组中分别取出0.4 mL的溶液，放入离心管中，加入0.1 mL 0.03 mol/L的NaNO2，常温下2000 r/min离心10 min，用0.85%的生理盐水洗涤，常温离心2000 r/min，5 min，吸取上清液，在沉淀中加入3 mL TxitonX-100轻摇，分别用588.7 nm和628 nm的紫外光测定吸光度，根据公式 MetHb/%=（A628-0.02A588.7）/0.96A588.7×100 测定膜的通透性。

1.3 统计学处理

求平均值和方差。

2 结果与分析

2.1 原花青素对H2O2诱导的RBC溶血度的影响

原花青素对H2O2诱导的RBC溶血度的影响结果见图1。

图1 原花青素对H2O2诱导的RBC溶血度的影响Fig.1 Proanthocyanidins on H2O2-induced hemolysis of RBC

从图1中可以看出，原花青素对于细胞氧化受损后的溶血情况确实有抑制作用，并且随着原花青素浓度的增大，溶血百分比也相应的增大。原花青素抑制溶血有最适的浓度范围，在此范围内，细胞溶血量最小。当原花青素浓度过大时，可能由于渗透压的原因，也会使红细胞溶血度略有增加。

2.2 原花青素对H2O2诱导的RBC MDA含量的影响

丙二醛（MDA）含量的测定，是最直接的测定膜中脂质氧化程度的重要参数。原花青素对H2O2诱导的RBC MDA含量的影响结果见图2。

图2 原花青素对H2O2诱导的RBC MDA含量的影响Fig.2 proanthocyanidins on H2O2-induced RBC MDA content

从图2中我们可以看出，原花青素对脂质氧化也有明显的抑制作用。在浓度为0.2 mg/L和0.4 mg/L之间，MDA含量最低，表明抑制程度最明显，这与溶血量得出的结果相一致。但是在原花青素为0.05 mg/L时，出现了高峰，我们认为可能与操作时的误差有一定关系。

2.3 原花青素对H2O2诱导的RBC高铁血红蛋白含量的影响

细胞膜对NaNO2是不能透过的，但是受损的细胞膜通透性会发生变化，而NaNO2进入细胞后会使细胞内的亚铁血红蛋白生成高铁血红蛋白，因此测量细胞内高铁血红蛋白的含量就会反映出细胞膜的受损情况。原花青素对H2O2诱导的RBC高铁血红蛋白含量的影响结果见图3。

图3 原花青素对H2O2诱导的RBC高铁血红蛋白含量的影响Fig.3 proanthocyanidins on H2O2-induced RBC levels of methemoglobin

从图3中可以看出，对照组的细胞膜通透性很大，而加入原花青素的实验组膜通透性降低并且当原花青素的浓度是0.4 mg/L时，膜通透性最小，推测此浓度的原花青素对细胞膜的保护程度最大。

3 讨论与结论

红细胞（RBC）是血液的主要有形成分，在血液中担负着对组织进行气体交换的作用。此外，RBC膜富含不饱和脂肪酸，这种不饱和脂肪酸对活性氧诱导的过氧化非常敏感，因此是最容易受到过氧化损伤的细胞。H2O2是活性氧的一种，在生理条件下，细胞线粒体、微粒体、浆膜和胞浆中均可产生。本研究选择H2O2作为损伤因素，而抗氧化剂可以清除活性氧，抑制脂质过氧化，维持细胞内环境的平衡。

自由基诱导的生物膜脂质过氧化反应是组织损伤的基础，许多疾病和外源性损伤的病理过程都与自由基反应有关[3]。在病理状态或衰老的情况下，人体内自由基产生过多或清除过少都对机体造成氧化损伤。

从溶血量、MDA含量、膜通透性测定的实验数据可知，原花青素对血细胞的确可以抑制其受到H2O2的氧化损害。并且这种抑制作用在一定范围内和原花青素的浓度呈正相关，浓度越大，保护作用越大。但是当超过一定范围时，由于渗透压的原因，将会出现破坏细胞的现象。

原花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素,属黄酮类化合物，它作为羟基供体,是活性氧的有效清除剂，它能和蛋白质结合防止自由基伤害尤其是脂质过氧化,使细胞维持一定的结构，对细胞起着良好的保护作用，而且其优越的抗氧化活性也越来越为人们所青睐。我们相信，随着科技的进步，植物原花色素的开发与研究前景广阔，在食品、医药、精细化工品等领域可望获得更高的利用价值。

[1]刘慧明，丁航，侯敢.檞皮素对过氧化氢诱导的人红细胞过氧化损伤的抑制作用[J].广东医学院学报，2003，21(4)：317-318

[2]侯志孝.自由基相关疾病及抗氧化中药研究[J].天津药学，1996,8(1)：18－21

[3]马兰萍，刘在群，周波，等.绿茶多酚对自由基诱导的红细胞氧化性溶血的抑制作用[J].科学通报,2000,45(12):1271-1275

The Effect of Procyanidins in Inhibition of Cell Damage

GE Yu-tong,RONG Chan,CUI Qian,XU Ying-ying,BU Fan-hao,FENG Juan-juan,HE Yan-ming*
（School of Life Science,Sun Yat-Sun University,Guangzhou 510275,Guangdong,China）

The destination upon the research was to explore the inhibition of procyanidins on cell membrane oxidative damage,as well as the relationship between procyanidins concentration and the inhibition.We manipulated 1%rabbit blood erythrocytes (RBC)suspension and manufacture H2O2oxidation model.The experimental group was treated with different concentration of procyanidins solutions before joining the H2O2.hemolysis,cell membrane permeability,and malondialdehyde(MDA)level of which was determined.Compared with CK group,procyanidins treatment resulted in a dose-dependent decrease of hemolytic degree and MDA content.When the concentration of procyanidins was between 0.2mg/L and 0.4 mg/L,antioxidant was most obvious effect.Procyanidin had the capability of inhibiting hydroperoxide-induced hemolysis and peroxidetion of RBC,which was positively associated with concentration of procyanidins with limitation.

procyanidins;cell membrane;oxidation membrane;MDA concentration;hemolytic volume

国家人才基金项目（J0730638）；中山大学实验室开放基金（KF200928）

葛昱彤（1988—），女（汉），本科，研究方向：生物化学。

*通信作者：何炎明（1954—），男（汉），高级工程师，主要研究方向：细胞生物学，植物生理。

2011-11-01