植物乳杆菌MA2的生物学特性研究

许女，王艳萍，习傲登，张玢

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2.教育部天津市食品营养与安全重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

植物乳杆菌MA2的生物学特性研究

许女1，王艳萍2，*，习傲登2，张玢2

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2.教育部天津市食品营养与安全重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

对Kefir源植物乳杆菌MA2的生物学特性进行了研究，结果显示，MA2菌株在MRS培养基初始pH为6.60，接种量为4%，37℃厌氧条件下培养18 h，活菌数可达到1.2×109cfu/mL。乙酸和乳酸为发酵液中的优势有机酸，且厌氧条件下发酵液中的有机酸的含量较高，厌氧发酵液中检测出的6种脂肪酸中C18:1的含量最高。降胆固醇试验证明，低聚葡萄糖（GOS）可以促进MA2的胆固醇移除能力，移除率可达到70%；菌体细胞脂肪酸的测定结果显示MA2菌株降胆固醇的机理主要是吸附、吸收同化机理。MA2菌株的牛乳发酵试验结果显示其具有良好的产黏特性，在乳清培养基中胞外多糖产量可达380 mg/L。结合其良好的耐酸、耐胆盐特性，植物乳杆菌MA2具有良好的益生菌应用潜力。

植物乳杆菌；生物学；特性

近年来，益生菌产业蓬勃发展，产品形式多样，日本在20世纪60年代就开始使用益生菌，并较早形成了产业规模。美国、西欧从20世纪70年代也开始有益生菌上市[1]。而我国益生菌及其制品的研究起步比较晚，直到1992年中国微生态学会成立后，市场上才出现了一些益生菌产品[2]。益生菌产业在我国已经是一个非常大的产业，目前市场份额已经超过10亿元人民币，因此，筛选和开发适合我国乳品工业和益生菌制剂业发展的益生菌菌种，真正实现具有自主知识产权的益生菌菌种、发酵剂、益生菌制剂及益生菌发酵乳制品的市场化，缩短与发达国家在该领域的差距，显得尤为重要，这有利于我国科技创新体系的形成以及乳酸菌产业和乳品工业的可持续发展[3]。

Kefir是一种集酸味、醇味于一体的发酵乳制品，具有独特的营养价值和生理功能，在国内外有悠久的饮用历史[4]。Kefir粒中含有多种益生菌，是重要的益生菌资源，目前已成为国内外的研究热点。本文对从西藏Kefir粒中分离的一株植物乳杆菌MA2的生长、耐酸、耐胆盐，降胆固醇，产黏等生物学特性进行了研究，进而为开发我国具有自主知识产权的益生菌发酵剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种

植物乳杆菌 MA2（LactobacillusplantarumMA2），分离自西藏农家Kefir粒，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保存编号为CGMCC3005。

1.2 主要仪器设备

Avanti J－E型柜式冷冻离心机：Beckman Coulter US；GC-7890Ⅱ型气相色谱仪：上海天美公司；GC-2010型气相色谱仪：日本岛津仪器公司；DZKW-C型水浴锅：河北省黄骅仪表厂；UV-9100型紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司。

1.3 主要试验方法

1.3.1 MA2菌株发酵液中有机酸和脂肪酸含量的分析

1.3.1.1 仪器与色谱条件

1）有机酸测定的仪器与色谱条件

气相色谱仪（GC-7890Ⅱ型，上海天美公司），FID检测器。色谱柱：GDX401填充柱。温度：进样器，240℃；色谱柱，200℃；检测器，240℃。气体流速：载气（N2），40 mL/min；氢气，40 mL/min；空气，400 mL/min。进样量：1 μL。

2）脂肪酸测定的仪器与色谱条件

气相色谱仪（GC-2010型，日本岛津仪器公司），FID检测器。色谱柱：毛细管柱CBP 20（50 m×0.2 mm×0.2 μm）。温度：进样器，280℃；色谱柱，240℃；检测器，280℃。柱流速：0.71 mL/min。气体流速：载气（N2），30 mL/min；氢气，47 mL/min；空气，399.8 mL/min。分流比：1:10。进样量：1 μL。

1.3.1.2 有机酸的测定

发酵液中挥发性有机酸的测定：将MA2在MRS培养基中的有氧和厌氧发酵液（接种量4%，37℃，18h）离心（10000 r/min，20 min，4℃），弃菌体沉淀。取50 mL上清液浓缩至5 mL，用50%硫酸酸化至pH为2～3，供气相分析用。发酵液中非挥发性有机酸的测定：将浓缩的5 mL乳酸菌发酵上清液加入50%硫酸2 mL，甲醇10 mL，75℃密闭反应1 h进行衍生处理，待冷却后加入5 mL三氯甲烷，10 mL水。用旋涡混合器充分混匀，再以5000 r/min离心10 min，最后吸取三氯甲烷层供气相色谱分析。

1.3.1.3 脂肪酸的测定

取50 mL乳酸菌发酵上清液浓缩至10 mL后，加入等体积三氯甲烷-甲醇抽提，有机相蒸发至干，加入4%H2SO4:CH3OH 2 mL，75 ℃密闭反应 1 h。待冷却后加入2 mL水，2 mL正己烷，静置，分层。取正己烷层加入适量无水Na2SO4干燥，滤出干燥剂，滤液即为甲酯化试样。然后用气相色谱法分析各试样的脂肪酸组成。

1.3.2 MA2菌株的耐酸、耐胆盐特性研究

1.3.2.1 耐酸性实验[5]

将菌株MA2于MRS液体培养基中活化后，按体积分数为4%的接种量分别接种于200 mL pH为2.0的MRS液体培养基中，37℃厌氧静置培养，于0、30、60、90、120 min分别取样，采用MRS固体培养基进行活菌计数。

1.3.2.2 胆盐特性实验[6]

将菌株MA2于MRS液体培养基中活化后，按体积分数为4%的接种量接种于200 mL

含有0.3%、0.5%牛磺胆酸钠的MRS液体培养基中，37 ℃厌氧静置培养，0、1、2、3、4 h 分别取样，采用MRS固体培养基进行活菌计数。

1.3.3 胆固醇的测定方法[7]

将MA2按4%（体积分数）的接种量接种于含有胆固醇终浓度为30 mg/100 mL的MRS-CHO液体培养基中，37℃厌氧培养，每4小时取样，测量发酵液的OD（600 nm）值和胆固醇的降解率，以培养时间为横坐标，OD（600 nm）值和胆固醇的降解率纵坐标，绘制菌体的生长曲线和胆固醇移除率曲线。

采用邻苯二甲醛比色法测上清液中的胆固醇，以未接菌的MRS-CHO液体培养基作为对照，计算胆固醇降解率。

胆固醇的降解率＝（未接菌的MRS-CHO培养基中上清液中胆固醇含量—接菌的MRS-CHO培养基中上清液中胆固醇含量）/未接菌的MRS-CHO培养基中上清液中胆固醇含量×100%

1.3.4 MA2菌株产胞外多糖的性能测定

将MA2菌株按4%的接种量，接入适合产胞外多糖的乳清培养基[8]中，37℃下静置厌氧培养24 h，将发酵液于100℃水浴30 min后，冷却到4℃，10000 r/mim离心20 min除去菌体，吸取一定量的上清液装入透析袋，在4℃蒸馏水中透析，期间一段时间更换蒸馏水，用苯酚硫酸法[9]检测直至蒸馏水不出现紫环后，同样以苯酚硫酸法测定透析袋内胞外多糖含量。

1.3.5 发酵乳的黏度、乳清析出率的测定[9]

1.3.5.1 黏度的测定

美国BROOKFIELD公司，DV-Ⅲ＋型黏度计（三号转子，100 r/min）测定发酵奶的黏度。

1.3.5.2 乳清析出率的测定

4℃冷藏期间，每4天进行取样测定。将50 mL凝固的酸乳小心倾入带有120目不锈钢丝网的漏斗中，收集沥出的乳清，记录其体积，收集时间为2 h。

2 结果与讨论

2.1 植物乳杆菌MA2的生长特性

植物乳杆菌MA2的生长特性见表1。

表1 培养条件对菌株MA2生长的影响Table 1 Influences of incubation conditions on strain MA2 growth

表1显示了不同的培养条件对菌株MA2生长的影响。结果显示：MA2菌株在MRS培养基初始pH为6.60，接种量为4%，37℃厌氧条件下培养18 h，活菌数可达到1.2×109cfu/mL。

2.2 植物乳杆菌MA2发酵液中有机酸和脂肪酸含量的分析

按照1.3.1的方法分别对MA2菌株在有氧和厌氧发酵的情况下，发酵液中有机酸和脂肪酸的含量进行了测定，见表2。

表2 菌株MA2发酵液中有机酸和脂肪酸的含量Table 2 Amount of organic acids and fatty acid methyl esters of strain MA2

结果显示：乙酸和乳酸为发酵液中的优势有机酸，且厌氧条件下发酵液中的有机酸的含量较高，二者含量分别为36.67 mg/mL和5.01 mg/mL。另外，MA2厌氧发酵液中共检测出 6 种脂肪酸 C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、C18:3 和 C20:1，其中以 C18:1 的含量最高，相对含量达到30.91%。

2.3 MA2菌株的耐酸、耐胆盐特性研究

按照1.3.2的方法测试了MA2菌株的酸和胆盐耐受性。实验结果见表3。

表3 菌株MA2的耐酸性和耐胆盐特性Table 3 Tolerance to acid and bile salts of strain MA2

从表3可知，MA2菌株在pH为2的酸性培养基中培养2 h后，活菌数从108下降到106，显示出较好的耐酸特性。当培养基中的胆盐添加浓度为0.3%时，MA2菌株的活菌数4 h之内从108下降到106，下降了两个数量级，而当胆盐浓度为0.5%时，活菌数则下降了3个数量级。证明MA2菌株可以抵抗较强的胃液的酸性（pH为2～3）环境和较高浓度的胆酸环境（胆汁浓度0.3%～0.5%），顺利地到达肠道，并在肠道存活，发挥其益生功能作用。

2.4 MA2菌株的降胆固醇性能测定

2.4.1 菌体生长与降胆固醇的关系

图1显示了MA2菌株（接种量为4%）在MRS-CHO（胆固醇的终浓度为30 mg/100 mL）培养基中的生长与胆固醇移除率之间的关系。

图1 菌株MA2在MRS-CHO中的生长曲线及胆固醇的移除率Fig.1 Growth profiles in MRS-CHO and cholesterol removal patterns for strain MA2

由图1可知，植物乳杆菌MA2的胆固醇移除率与菌体的生长呈正相关，这与Liong[5]和Kimoto[10]等研究的结果相似。植物乳杆菌MA2在8 h～16 h即对数生长期时，胆固醇的移除速率最快，24 h时胆固醇的移除率达到55%±4.5%。

2.4.2 益生元的添加对MA2菌株降胆固醇性能的影响图2显示了MRS-CHO培养基中各种益生元的添加（终浓度为0.5%）对MA2菌株降胆固醇性能的影响，结果表明低聚葡萄糖可以显著提高MA2的胆固醇移除率。

图2 益生元的添加对菌株MA2胆固醇移除率的影响Fig 2 The influence of oligosaccharides on cholesterol removal by strain MA2

菌落计数结果验证，相比于添加其它种类的低聚糖，低聚葡萄糖更能促进MA2菌株在MRS-CHO培养基中的生长（数据未给出），进而导致胆固醇的移除率提高。Perrin S et al[11]，Strobel et al[12]等报道，在体内，益生元和益生菌联用，一方面，由于益生元低聚糖是益生菌的最适碳源，导致菌体得到更多的能量，因此可以提高菌体对胆盐的耐受性，进而发挥其胆盐水解酶或者吸收，同化胆固醇的作用；另一方面，在机体内，益生元即低聚糖的添加，丰富了益生菌发酵产生有机酸的底物，有机酸的产生可以促进肠道内益生菌的生长；Hong Yang，Fang Zhang[13]等就通过响应面的方法，体外筛选优化合生元，来达到降低体内降胆固醇的目的。

2.4.3 胆固醇对MA2菌株细胞脂肪酸组成的影响

为了进一步分析研究MA2菌株的降胆固醇机理，我们测定了在培养基中添加胆固醇和未添加胆固醇两种情况下，菌体细胞中脂肪酸的含量变化。由表4可知，在添加胆固醇的情况下，细胞中的 C16:1，C18:1不饱和脂肪酸的含量显著高于未添加胆固醇的情况，说明被菌体吸附到细胞膜上和吸收进细胞中的胆固醇，改变了菌体细胞的脂肪酸的组成。这和Kimoto[10]和Taranto[14]研究的Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis N7，Lactobacillus reuteri在 MRS-CHO 培养基中菌体细胞脂肪酸的改变情况相似，Kimoto认为菌体细胞中脂肪酸组成的变化，是由于菌体将培养基中的胆固醇吸收进细胞膜内所引起的。另外，Liong和 Shah[5]对 Lactobacillus acidophilus ATCC 33200、4356、4357、4692四株菌的降胆固醇作用的研究结果还证明，不仅添加在培养基中的胆固醇改变了这4株菌细胞的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的相对组成，而且Lactobacillus acidophilus ATCC 33200和Lactoba-cillus acidophilus 4692这2株菌在添加胆固醇的情况下，细胞中的总脂肪酸的含量显著高于未添加胆固醇的情况，Liong认为总脂肪酸含量的升高是由被吸附和吸收进菌体细胞中的胆固醇所引起的，并不是由菌体细胞自身合成的，因为Kiatpapan et al[15]曾经报道，乳酸菌在高脂环境下会丧失合成脂肪酸的能力。因此，我们认为MA2菌株是将胆固醇吸附结合在细胞膜上，进而吸收进细胞中，来移除培养基中的胆固醇，即吸收同化机理。

表4 胆固醇对MA2细胞脂肪酸组成的影响Table 4 Fatty acid composition of strain MA2 grown in the presence and absence of cholesterol

2.4.4 MA2菌株对发酵乳中胆固醇的降解作用

吸取发酵终点（40℃，有氧，5 h）的酸奶 10 mL，加入等体积的甲醇-三氯甲烷（2:1）混合液，混匀，离心（10000 r/min，20 min），取三氯甲烷层测定其胆固醇的含量，以发酵0 h的样品为对照计算胆固醇的降解率，实验结果见表5。

表5 MA2菌株对发酵乳中胆固醇的降解Table 5 Cholesterol removal of fermented milk by MA2

由表5可知，相比于发酵前的原料乳，A、B 2种发酵乳中的胆固醇含量都有所降低，但是添加了MA2菌株的发酵乳B中的胆固醇的降解率更高。

2.5 MA2菌株产黏特性的研究

产胞外多糖的乳酸菌可以为酸奶提供黏度、稳定性和保水性。多年来欧洲的各公司大力地将产胞外多糖的乳酸菌应用在酸奶生产中，可以满足当今消费者对产品的低糖、低脂、和少放食品添加剂的要求。本文采用苯酚硫酸法测定了植物乳杆菌MA2在乳清培养基中产胞外多糖的能力，最终测得MA2在乳清培养基中胞外多糖的产量为380 mg/L。

图3 发酵乳在冷藏期间黏度的变化Fig.3 Viscosity changes of yoghurt stored at 4℃

图4 发酵乳在冷藏期间乳清析出率的变化Fig.4 Whey separation of yoghurt stored at 4℃

图3和图4描述了添加了植物乳杆菌MA2发酵剂的酸乳在4℃储存期间黏度和乳清析出率的变化，结果所示，添加了植物乳杆菌MA2的发酵乳B的黏度显著高于未添加MA2菌种的普通酸奶A，且在0～16 d内，发酵乳B的黏度呈上升趋势，16 d以后黏度趋于稳定，到20 d时黏度稍微下降，可能是因为储存到20 d时，酸奶的乳清析出比较多，导致黏度下降。而发酵乳A在0～8 d时，黏度上升较快，8 d以后黏度上升减慢，12 d时黏度趋于稳定，到20 d时黏度稍微下降。产胞外多糖（EPS）的乳酸菌对提高酸乳的质地、增加粘度、减少乳清析出，具有重要的意义；而且乳酸菌胞外多糖作为一种增稠剂[9]，安全性得到公认，另外，乳酸菌胞外多糖还具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂等多种生理功能。本试验中的植物乳杆菌MA2提高了酸奶的黏度，降低了储存期间酸乳的乳清析出率，分析原因可能是因为MA2菌株具有产胞外多糖的能力，具有良好的乳制品发酵剂应用前景。

3 结论

本试验对Kefir源植物乳杆菌MA2的生长特性，耐酸、耐胆盐，降胆固醇及产黏等生物学特性进行了研究，结果证明，MA2菌株在MRS培养基初始pH为6.60，接种量为4%，37℃厌氧条件下培养18 h，活菌数可达到1.2×109cfu/mL；结合良好的耐酸、耐胆盐特性及良好的牛乳发酵产黏特性及降胆固醇性能，使其具有良好的益生菌乳制品发酵剂应用前景。

[1]许女,王艳萍,习傲登,等.Kefir源植物乳杆菌MA2的牛乳发酵特性研究[J].中国酿造,2011,232(7):33-38

[2]张和平.中国益生乳酸菌及益生发酵乳研究开发现状及发展对策[J].乳业科学与技术,2009,32(2):51-54

[3]张和平.我国益生乳酸菌研究与产业化现状及发展对策[J].生物产业技术,2009,6:53-55

[4]郭兴华.益生菌基础与应用[M].北京:北京科学技术出版社,2002,45-65

[5]Liong M T,Shah N P.Acid and Bile Tolerance and Cholesterol Removal Ability of Lactobacilli Strains[J].J Dairy Sci,2005,88(1):55-66

[6]Pereira DIA,Gibson GR.Cholesterol Assimilation by Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria Isolated from the Human Gut[J].Appl Environ Microb,2002,68(9):4689-4693

[7]Parvez S,Kim H Y,Lee H C,et al.Bile salt hydrolase and cholesterol removal effect by Bifidobacterium bifidum NRRL[J].World J Microbio Biot,2006,22:455-459

[8]王艳萍,习傲登,许女,等.嗜酸乳杆菌高密度培养及发酵剂的研究[J].中国酿造,2009,206(5):111-116

[9]罗玲泉.增稠剂的复配对酸乳乳清析出的影响研究[J].食品研究与开发,2008,29(8):136-139

[10]Kimoto H,Ohmomo S,Okamoto T.Cholesterol Removal from Media by Lactococci[J].J Dairy Sci,2002,85(12):3182-3188

[11]Perrin S,Grill J P,Schneider F.Effects of fructooligosaccharides and their monomeric components on bile salt resistance in three species of bifidobacteria[J].J Appl Microbiol,2000,88:968-974

[12]Strobel HJ,Caldwell FC.Dawson KACarbohydrate transport by the anaerobic thermophile Clidiuostrm thermocellum LQRI[J].Appl Environ Microbiol,1995,61:4012-5012

[13]Zhang F,Hang X M,Fan X B,et al.Selection and optimization procedure of synbiotic for cholesterol removal[J].Anaerobe,2007,13:185-192

[14]Taranto MP,Fernandez Murga ML.Bile salts and cholesterol induce changes in the lipid cell membrane of Lactobacillus reuteri[J].Journal of Applied Microbiology,2003,95:86-91

[15]Kiatpapan PH,Kobayashi M,Sakaguchi H,et al.Molecular characterization of Lactobacillus plantarum genes for β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III (fabH)and acetyl coenzyme A carboxylase(accB-CDA),which are essential for fatty acid biosynthesis[J].App Environ Microbiol,2001,67:426-433

Biological Characteristics of Lactobacillus plantarum MA2

XU Nü1,WANG Yan-ping2,*,XI Ao-deng2,ZHANG Bin2
（1.Food Science and Engineering College,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,Shanxi,China;2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China）

Biological characteristics of Lactobacillus plantarum MA2 Strain from Kefir Grains was studied in this experiment,the results showed:the concentration of strain MA2 could reach 1.2×109cfu/mL by the 18 h of anaerobic fermentation,when MRS initial pH was 6.60,inoculum was 4%,temperature was 37℃;The quantitative analysis of the organic acids and fatty acid of strain MA2 showed that acetic acid and lactic acid was the main acid in both aerobic fermentation and anaerobic fermentation broth,C18:1 was the most fatty acid in six kinds of fatty acid methyl ester detected in anaerobic fermentation broth。Additionally,glucose oligosaccharide(GOS)could improve the cholesterol removal of strain MA2,and the removal amount could might reach up to 70%;The changes of cell fatty acid composition suggested that cholesterol removal mechanism of strain MA2 was mainly binding,absorbing cholesterol into cell and assimilation.Yoghurt fermentation test showed that MA2 has a good sticky characteristics,and the EPS production could reach up to 380 mg/L in whey medium;Combined with its excellent resistance to acid and bile tolerance characteristics,strain MA2 has a good potential probiotics market.

Lactobacillus plantarum MA2;biological;characteristics

国家科技支撑计划项目（2009BADC1B02）；山西农业大学引进人才科研启动基金项目（XB2009012）

许女（1979—），女（汉），讲师，博士，研究方向：益生菌及功能性乳制品的研究。

2012-03-23