非法添加抗痛风类化学药检测方法的研究

张少敏，陈 斌，凌善文，余岳林（上海市闸北食品药品检验所综合实验室，上海200435）

［本文编辑］阳凌燕

根据药品作用机制可将抗痛风药分为五类：（1）抑制粒细胞浸润药，如秋水仙碱；（2）抑制尿酸生成药，如别嘌醇；（3）促进尿酸排泄药，如丙磺舒、苯溴马隆等；（4）非甾体抗炎药，如吲哚美辛、布洛芬等；（5）糖皮质激素类，如泼尼松。治疗痛风急性发作，可应用秋水仙碱、非甾体抗炎药和糖皮质激素；控制慢性痛风可用促尿酸排泄药和抑制尿酸生成药［1］。上述抗痛风药均有一定的毒副作用，必须遵照医嘱服用。然而，一些不法企业为谋求暴利，擅自在中成药和保健食品中添加上述化学药物，给民众带来极大的安全隐患。为打击此类不法行为，确保临床用药安全，作者查阅了现行检验标准（国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件，编号2006006、2008001、2008002、2008014）和相关文献资料［2－5］，发现用于检测抗痛风药的现行标准基本上都要用到质谱技术，且上述药品种类繁多，不便于基层药品检验机构进行筛查检验。为此，作者采用HPLC－二极管阵列法（DAD）结合电子版药品标准管理系统快速筛查，并用红外光谱法进一步确证，经文献检索，尚未查到类似的方法。

1 仪器和试药

高效液相色谱仪（包括Waters 2695主机高精度四元梯度泵、自动进样器、Waters 2996二极管阵列检测器、Waters Empower色谱管理软件等，美国Waters公司）；电子版国家药品标准（武汉天罡医药软件有限公司）；秋水仙碱对照品（批号101176－201001）、丙磺舒对照品（批号100760－200329）、吲哚美辛对照品（批号100258－200904）、双氯芬酸钠对照品（批号100880－200601）、醋酸泼尼松对照品（批号100012－200706）、醋酸氢化可的松对照品（批号100123－200303）、地塞米松对照品（批号100129－200303）、泼尼松龙对照品（批号100123－200603）、丙酸倍氯米松对照品（批号100119－9802）均由中国食品药品检定研究院提供；投诉样品：抗痛风胶囊1批（厂家为不实信息）；硅胶GF254高效薄层板（德国Merk公司）；其他试剂均为市售分析纯。

2 方法和结果

2.1 溶液的配制 精密称取“1仪器和试药”项下各对照品适量，加甲醇分别制成浓度为1mg／ml的对照品溶液。取投诉样品抗痛风胶囊装量差异项下的内容物，混合均匀，精密称取约相当于2粒的量，加甲醇50ml超声提取30min，放冷，用甲醇稀释至刻度，过滤，滤液作为供试品溶液。

2.2 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以庚烷磺酸钠（庚烷磺酸钠15.2mg，加三乙胺0.8ml，加水至1 000ml，用冰乙酸调pH 值至3.3±0.1）－甲醇－乙腈（25∶30∶0.18）为流动相，检测波长为全波长，柱温30℃，流速1.0ml／min，进样量10μl。

2.3 HPLC－DAD－电子版药品标准管理系统筛查将样品溶液以2.2项色谱条件进样，色谱图见图1。从色谱图两个色谱峰中提取的二极管阵列紫外图谱见图2。根据紫外图谱得到的最大或最小吸收波长等信息作为搜索词条，在电子版药品标准管理系统中进行查询，并从有相关信息的药品中根据投诉样品所声称的疗效或药理作用等进行筛选。

图1 投诉样品抗痛风胶囊的HPLC谱图（波长254nm）Figure 1 HPLC photogram of complaint sample Kangtongfeng capsules（λ＝254nm）

2.4 红外分光光度法确认 疑似添加化学药成分的样品用薄层色谱法分离纯化。将样品溶液在高效薄层板上点成一排，以乙酸乙酯－氯仿－冰乙酸（25∶25∶0.2）为展开剂，展开，取出晾干，置紫外灯（254nm）下检视。将不同的色带分别用刀片刮取下来收集至试管中，用甲醇超声提取15min，过滤，滤液蒸干，残渣分别用溴化钾压片并进行红外光谱分析。样品两个斑点的红外图谱与醋酸泼尼松和双氯芬酸钠的对照图谱一致。

图2 投诉样品抗痛风胶囊中A、B峰的紫外光谱图Figure 2 Ultraviolet spectrograms of A and B peaks in complaint sample Kangtongfeng capsules

2.5 线性关系考察 由于上述方法只检出双氯芬酸钠和醋酸泼尼松两个成分，因此含量测定的方法学考察只考察这两个成分。精密量取双氯芬酸钠对照品溶液1、2、4、6、8ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度；精密量取醋酸泼尼松对照品溶液1、2、4、6、8ml置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按2.2项下色谱条件测定，以峰面积（A）对进样浓度（c）作标准曲线，分别计算双氯芬酸钠和醋酸泼尼松的回归方程。双氯芬酸钠：A＝2.027 5×108c＋6 623，r＝0.999 9。双氯芬酸钠在0.1～0.8mg／ml浓度范围内具有良好的线性。醋酸泼尼松：A＝3.014 6×107c－1 967，r＝0.999 9。醋酸泼尼松在0.02～0.16mg／ml浓度范围内具有良好的线性。

2.6 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液，在2.2项色谱条件下连续进样6次，计算双氯芬酸钠和醋酸泼尼松的RSD，分别为0.39%和0.43%（n＝6）。

2.7 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液，在2.2项色谱条件下，每2h测定1次，连续测定7次，结果表明供试品溶液在12h内稳定，样品中双氯芬酸钠和醋酸泼尼松的RSD分别为0.37%和0.52%（n＝7）。

2.8 加样回收率实验 取已知含量（相当于0.5粒抗痛风胶囊）的样品，精密称取3份，分别加入双氯芬酸钠对照品8.0、10.0、12.0mg和醋酸泼尼松1.5、1.8、2.2mg，按2.1项下方法制备供试品溶液，以2.2项下色谱条件测定，计算回收率。双氯芬酸钠的平均回收率为98.1%，RSD为1.56%（n＝3）；醋酸泼尼松的平均回收率为99.3%，RSD为1.53%（n＝3）。

2.9 投诉样品检验结果 用2.2项色谱条件对一群众投诉的样品进行检测。该样品名标注为“抗痛风胶囊”，生产厂家经调查为不实信息，说明书中的成分标注为“由人参、藏红花、冬虫夏草、川牛膝、当归、蒲公英、木瓜、鹿角霜、大黄、车前子、泽泻、何首乌等珍贵药材组成”。经检验，该胶囊的色谱图中只显示两个峰，它们的HPLC保留时间分别与醋酸泼尼松和双氯芬酸钠对照品一致；薄层色谱的Rf值也与醋酸泼尼松和双氯芬酸钠对照品一致。经红外光谱分析，它们的红外光谱与相应的对照图谱一致，因此可以确定为醋酸泼尼松和双氯芬酸钠。经含量测定，结果为每粒胶囊中含有双氯芬酸钠20mg，醋酸泼尼松3.5mg。

3 讨 论

3.1 筛查方法 本研究采用了HPLC－DAD结合电子版药品标准管理系统进行筛查。当投诉样品送达实验室时，应根据样品标示的药效或功能来考虑可能添加的化学药类别。由于该投诉样品用于痛风病治疗，因此建立了主要针对非甾体抗炎药和糖皮质激素类药物的HPLC法。经HPLC法分析，其液相色谱图基线很平整，基本上为一条直线，且只有两个峰，因此初步推断该胶囊中可能不含中药成分，仅含两种化学药。接着对两个峰进行二极管阵列紫外光谱的检测，其中一个峰的最大吸收波长为240.2nm，把240nm作为搜索词条在电子版药品标准管理系统中进行搜索，结果发现醋酸氟轻松、醋酸去氧皮质酮、倍他米松、醋酸可的松、醋酸泼尼松、曲安奈德和左炔诺酮在240nm波长处有最大吸收，再根据药理作用基本可以确定该成分应该为糖皮质激素，然后根据对照品溶液HPLC的保留时间和薄层色谱的Rf值很快就推断出该成分为醋酸泼尼松，同理也很快推断出另一成分为双氯芬酸钠。

3.2 红外图谱的比对 由于每个有机化合物都有其特定的红外吸收光谱，因此红外吸收光谱是定性分析的有力工具。作者用高效薄层板对投诉样品中的成分进行分离纯化，得到的纯品用溴化钾压片后进行红外光谱分析，两个成分的红外图谱与醋酸泼尼松和双氯芬酸钠的对照图谱一致，由此从HPLC法的保留时间、紫外图谱、薄层色谱的Rf值和红外图谱四个方面的分析，可以推断出两个成分分别为醋酸泼尼松和双氯芬酸钠。

3.3 提取溶剂的选择 由于完全是未知样品，因此对提取溶剂进行了考察。取适量样品5份，分别加入甲醇，80%、60%、40%、20%甲醇20ml，超声提取30min，过滤，测定，结果用甲醇处理效果最佳。3.4 提取时间的选择 取适量样品6份，各置50ml具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，分别超声处理10、20、30、40、50、60min后，测定，计算，结果在30min内提取完全，故选择超声30min即可。

［1］周广宇.抗痛风药的作用机制与分类［J］.中国社区医师，2002，18（7）：23－24.Zhou GuangYu.The mechanism and classification of gout suppressants［J］.Chin Commun Doct，2002，18（7）：23－24.Chinese.

［2］吴小红，李焕德，朱荣华，等.HPLC－MS／MS法鉴别中药制剂中非法添加的多种解热镇痛类化学药物［J］.中南药学，2010，8（10）：724－729.Wu XiaoHong，Li HuanDe，Zhu RongHua，etal.Identification of antipyretic analgesic chemicals illegally added to proprietary Chinese medicine and healthy food by HPLC－MS／MS［J］.Centr South Pharm，2010，8（10）：724－729.Chinese with abstract in English.

［3］许江红，张美雯，张若良.麝香风湿胶囊中非法添加双氯芬酸钠的检查［J］.中国药事，2010，24（10）：1013－1014.Xu JiangHong，Zhang MeiWen，Zhang RuoLiang.Identification of illegal adding of diclofenac sodium in Shexiang fengshi capsules［J］.Chin Pharm Aff，2010，24（10）：1013－1014.Chinese with abstract in English.

［4］燕朝丽.液质联用检测消肿止痛中成药的氨基比林及双氯芬酸钠［J］.中国药师，2010，13（12）：1173－1175.Yan ChaoLi.Determination of aminopyrine and diclofenac sodium illegally added into detumescent and analgesic Chinese medical preparation by HPLC－MS／MS［J］.China Pharmacist，2010，13（12）：1173－1175.Chinese with abstract in English.

［5］宁素云，郭兴杰，张 虹，等.HPLC法同时检测清热解毒类中成药中非法添加的9种化学药品［J］.中国药事，2009，23（9）：907－910.Ning SuYun，Guo XingJie，Zhang Hong，etal.Detection of 9 illegal components in traditional Chinese medicine by HPLC［J］.Chin Pharm Aff，2009，23（9）：907－910.Chinese with abstract in English.