用HPLC－电化学法测定盐酸肾上腺素预灌封注射剂中肾上腺素的含量

黄 娟，朱全刚，曹 洁，张玲娟＊

(1.第二军医大学长海医院护理部，上海200433；2.第二军医大学长海医院药学部，上海200433)

[本文编辑]兰 芬

预灌封注射剂是近年来悄然兴起的一种新型、实用的药品包装形式，系将药物溶液直接无菌灌装在可带注射针头的玻璃注射器中，注射器和药液包装容器合二为一。使用时无需反复抽吸、安装针头等操作，具有使用方便、剂量准确、减少污染等优点[1]，比使用安瓿包装的药品节约一半的时间，从而为战创伤、灾害救治及临床一线抢救危重病人争取宝贵时间。盐酸肾上腺素是一种直接作用于肾上腺素α、β受体的拟交感胺类药，具有扩张支气管、兴奋心脏、升高血压及收缩局部血管作用，常用于心跳骤停和过敏性休克的抢救，也可用于支气管痉挛、荨麻疹等严重过敏反应的治疗。因此，研制盐酸肾上腺素预灌封注射剂对于缩短临床抢救时间，提高抢救成功率具有重要意义[2]。本研究制备了盐酸肾上腺素预灌封注射剂，并建立了测定其含量的 HPLC－电化学(electrochemical detection，ECD)法。

1 仪器和试药

1.1 仪器 LD－10ADvp高效液相色谱仪(日本岛津制作所)，包括 LC－10ADvp泵、Class vp色谱工作站、CBM－20A系统控制器、SIL－10ADvp自动进样器、L－ECD－6A电化学检测器、CTO－10ACvp柱温箱和 C－R8A记录仪；FA－2004万分之一电子天平(上海天平仪器厂)；预灌封注射器组合件(山东威高集团医用高分子制品股份有限公司，批号111122，见图1)；SDJ－ZS生物超净工作台(上海淀山湖净化设备厂)。

图1 预灌封注射器的示意图

1.2 药品和试剂 肾上腺素对照品(99.7%，中国食品药品检定研究院，批号100154－2011－04)；盐酸肾上腺素注射液(规格1mg／1ml，上海禾丰制药有限公司，批号110605)；甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA，批号20100201)和冰乙酸(批号20100903)由上海凌峰化学试剂有限公司提供；庚烷磺酸钠(上海安谱科学仪器有限公司，批号CAEQ－4－020007－0100)；水为重蒸馏水(第二军医大学长海医院药学部自制)。

2 方法和结果

2.1 预灌封注射剂的制备 取盐酸肾上腺素注射液1支，将预灌封注射器组合件脱去外包装后置于生物超净工作台，在无菌条件下将注射液灌装入玻璃针管，压入活塞，将药液密封，然后加装推杆，进行包装，即得到盐酸肾上腺素预灌封注射液(批号120207、120208、120209)，在室温、避光条件下保存。

2.2 溶液的制备 (1)供试品溶液 精密量取预灌封注射剂适量(约相当于肾上腺素0.5mg)，置50ml量瓶中。流动相：水相[含0.11%庚烷磺酸钠溶液(含0.1mmol／L EDTA)和5%冰乙酸溶液 (用1mol／L NaOH溶液调节pH值至3.4)]－甲醇(80:20)；加流动相稀释至刻度，摇匀，制成浓度约为10μg／ml的供试品储备液。精密量取该储备液1ml，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。(2)对照品溶液 精密称取肾上腺素对照品10.0mg，置100ml量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg／ml的对照品储备液。精密量取该储备液0.05、0.25、0.5、1、5ml，分别置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得系列浓度分别为0.05、0.25、0.5、1、5μg／ml的对照品溶液。

2.3 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；采用电化学检测器，以玻碳电极为工作电极，银／氯化银电极为参比电极，工作电位为＋0.65V；柱温20℃，流动相见2.2项，流速1.0ml／min，进样量20μl。取供试品溶液和浓度为1μg／ml的对照品溶液分别进样，得到色谱图见图2。由图2可见，盐酸肾上腺素色谱峰不受其他组分干扰，峰形良好。

2.4 线性关系考察 精密量取2.2项下各浓度对照品溶液，按2.3项下色谱条件分别进样20μl，测定峰面积(A)。以浓度(c)为横坐标，A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A＝1.56×106c＋7.44×104(r＝0.999 9，n＝5)，表明盐酸肾上腺素在0.05～5μg／ml范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验 分别精密量取低、中、高浓度(0.05、0.5、5μg／ml)的对照品溶液各20μl，按2.3项下色谱条件，同1天内每隔4h重复进样，共3次，记录峰面积，计算得到低、中、高浓度的日内 RSD 分别为1.35%、1.14%和1.61%(n＝3)。每天进样一次，连续3d，记录峰面积，计算得到低、中、高浓度的日间 RSD 分别为3.68%、2.99%和3.63%(n＝3)，表明日内、日间精密度良好。

2.6 重复性实验 取同一批供试品溶液(批号120208)6份，按2.3项下色谱条件测定峰面积并计算含量，得到RSD＝1.11%(n＝6)。

图2 盐酸肾上腺素预灌封注射剂的HPLC谱图

2.7 稳定性实验 分别于配制后0、2、4、6、8、12h，精密量取2.2项下的供试品溶液20μl，按2.3项下色谱条件进样测定峰面积，计算得到RSD＝3.11%(n＝6)，表明供试品溶液在配制后12h内稳定。

2.8 加样回收率实验 精密量取适量2.2项下已知浓度为0.5μg／ml的供试品溶液3份，分别加入浓度为0.25、0.5、1μg／ml的对照品溶液1ml，得到低、中、高浓度分别为0.625、1、3μg／ml的混合溶液。按2.3项下色谱条件进样测定并计算含量。结果低、中、高浓度的加样回收率分别为(100.03±1.54)%、(104.60±1.15)%和(98.64±2.49)%(n＝3)，表明该方法的回收率满足测定要求。

2.9 样品含量测定 分别取3批预灌封注射剂(批号为120207、120208、120209)，制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样，测定峰面积，计算肾上腺素的含量，并求算其相当于标示量的百分比。结果得到3批样品中肾上腺素的含量分别为标示量的(99.04±1.94)%、(97.26±2.78)%和(100.51±1.15)%(n＝3)，均在标示量的85%～115%范围内，符合《中华人民共和国药典》2010版盐酸肾上腺素注射液的含量检测要求[3]。

3 讨 论

盐酸肾上腺素的含量测定方法有滴定法、紫外分光光度法和HPLC法等。《中华人民共和国药典》采用的是RP－HPLC法，以紫外检测为手段，灵敏度低，需较大进样量，易造成色谱柱容量过载。鉴于肾上腺素是具有电活性的酚类物质，本研究选用ECD为检测手段，灵敏度显著提高，可满足常规测定需要[4]。

肾上腺素为极性化合物，在非极性色谱柱上保留较弱。在酸性流动相中加入离子对试剂后，肾上腺素作为一种有机胺类物质，能与庚烷磺酸钠形成离子对，在固定相上保留增强，从而实现有效分离。研究过程中还考察了工作电位对检测灵敏度的影响，发现在酸性条件下以＋0.65V测定灵敏度高，峰形佳，因此选择＋0.65V为工作电位。本研究建立的HPLC－ECD法准确快速，灵敏度高，重现性好，能用于盐酸肾上腺素预灌封注射剂的含量测定。

[1]Nishiyama J，Suzuki T，Murata T，etal.A questionnaire survey on operability of syringe pumps for prefilled syringes[J].Tokai J Exp Clin Med，2010，35(3)：95－98.

[2]Kerddonfak S，Manuyakorn W，Kamchaisatian W，etal.The stability and sterility of epinephrine prefilled syringe[J].Asian Pac J Allergy Immunol，2010，28(1)：53－57.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010版 二部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：460.State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.2010ed.Volume 2[S].Beijing：Chinese Medical Science Press，2010：460.Chinese.

[4]金 薇，彭兴盛，陈 阳，等.HPLC－ECD测定重酒石酸去甲肾上腺素的有关物质[J].药物分析杂志，2011，31(8)：1485－1488.Jin Wei，Peng XingSheng，Chen Yang，etal.HPLC－ECD determination of related substances of norepinephrine bitartrate[J].Chin J Pharm Anal，2011，31(8)：1485－1488.Chinese with abstract in English.