树莓果实上产酯酵母菌的筛选和鉴定

马荣山，穆晶，王艳平

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161）

树莓果实上产酯酵母菌的筛选和鉴定

马荣山，穆晶*，王艳平

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161）

从树莓绿色果实上分离出一株产酯性能较好的菌株MJ-green-2010，经形态与培养特征，酵母菌假菌丝鉴定，生理生化实验和分子水平鉴定，确定为有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）的葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。

树莓果实；产酯酵母菌；筛选；鉴定

从目前已有的资料看，树莓其生产工艺都是先将性能优良的酵母菌株经过驯化后进行树莓产品的酿制[1]。菌株的优良特性在驯化过程中有可能全部或部分丧失，严重影响发酵产品的质量。为此，采用直接从树莓果上分离酵母菌株，并对其进行部分生理生化和分子水平鉴定[2-4]，以期从树莓果实上直接得到适应于树莓果汁特殊环境的优良酵母菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

酵母菌来源：MJ-green-2010来自沈阳东陵树莓基地的树莓果实。

试剂：蛋白胨、酵母膏、琼脂等为国产生化试剂；葡萄糖、EDTA、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、醋酸钾等为国产分析纯试剂；引物26S rDNA D1/D2区域NL1（5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3'）和NL4（5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'）由上海生工公司合成。

1.2 仪器与设备

YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器：上海三申医疗器械有限公司；SW-VJ-1F超净工作台：苏净集团安泰公司；TC-412PCR仪：TECHNE制造；DYY-6B稳压稳流电泳仪：北京市六一仪器厂；TGL-16C台式离心机：Anke制造；移液枪：eppendorf制造；UNIVERSALHOODS.N.76S/03822凝胶成像仪：BIO-RAD制造。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的筛选[5-8]及形态鉴定

树莓果实来自沈阳东陵树莓基地，将现场无菌操作采集的样品MJ-green-2010，浸入灭好菌的YPD液体培养基中，于25℃，48 h～72 h扩大培养，然后利用梯度划线法和稀释梯度分离法分离纯化，用YPD斜面培养基保藏，然后观察液体培养[9]和固体培养的菌体形态特征。

1.3.2 酵母菌理化鉴定[10-11]

1.3.2.1 糖类发酵实验

接收端在用户数据阶段判断/F/、/A/字节出现的位置,根据其是否出现在相应的帧尾/多帧尾,即可监测通道的同步状态,如果同步则需将/F/、/A/字节替换回原始用户数据;不同步则统计错误个数,超过错误阈值则表明链路失去帧/多帧同步,需进行重同步过程。

常规鉴定需要测试6种糖（葡萄糖、D－半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和D－果糖）的发酵结果。将这6种糖用蒸馏水配成质量分数20%的母液，过滤，灭菌。用蒸馏水配制质量分数0.5%的酵母浸出溶液，每次取出3.6 mL分装于口径12 mm的试管中，放入倒置的杜氏发酵管，棉塞封口，灭菌，然后每管内加入0.4 mL糖母液，备用。将活化好的菌种制成细胞悬液，以每管0.5 mL的量接种于发酵试管内，摇匀，25℃下培养2周，其间观察杜氏管内是否有气体产生。杜氏管内有气泡计为阳性，无气泡计为阴性。

1.3.2.2 碳源同化实验

液体试管法：每管加无碳基础培养基5 mL，加被测试的某种碳源（葡萄糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、乳糖、乙醇、可溶性淀粉、D-木糖、半乳糖、D-甘露醇、柠檬酸、肌醇），并以葡萄糖作对照。接入新鲜菌液1 mL，1周～2周后，观察。液体试管法培养同化结果的观察与记录方法：取一白色卡片，其上用墨汁或黑色墨水划上约3/4 mm宽的直线，透过培养液观察卡片上的黑线。透过试管看不见黑线记为+，为阳性；黑线清晰可见记为-，为阴性。

1.3.2.3 氮源同化实验

将测试酵母菌进行饥饿培养，以消耗细胞内多余的氮源，防止出现假阳性结果。将活化好的菌株接种在无菌碳基础培养基上，加入被测氮源（硫酸铵、亚硝酸钠、硝酸钾），25℃培养3 d～5 d。操作方法同上。

1.3.2.4 其它生理生化实验

37℃生长实验、耐高渗D-葡萄糖生长实验（50%质量分数）及生成类淀粉化合物实验37℃下生长实验、耐高渗D-葡萄糖生长实验（50%质量分数）、生成类淀粉化合物实验等参照《酵母菌鉴定手册》。

1.3.3 酵母菌分子水平鉴定[12-13]

提取菌株MJ-green-2010的基因组DNA，然后用合成引物NL1（5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3'）和 NL4（5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'）[14-16]PCR扩增其26S rDNA近5'端的D1/D2区域，PCR扩增反应循环参数设置如下：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，54℃复性1 min，72℃延伸1.5 min。36个循环[17-19]，72℃延伸10 min，然后冷却至4℃。PCR扩增反应体系（总体积50 μL）：Primer 1（10 pmol/μL）2.5 μL；Primer2（10 pmol/μL）2.5 μL；dNTP（200μmol/L）1.0 μL；10×Buffer 5.0 μL；TaqDNA聚合酶 （0.83×10-7kat/μL）1.25 μL；模板DNA 2.5 μL；ddH2O 35.25 μL。对所提取的DNA进行凝胶电泳观察，观察后将PCR扩增产物由某生物工程公司进行DNA测序。将测序结果用GenBank中的核酸序列数据库进行BLAST分析，再用DNASTAR中的MegAlign进行相似性分析，经MegAlign法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的筛选和形态鉴定

经过分离纯化得到单一菌落从形态上确定为酵母菌。将菌株MJ-green-2010液体培养特征为液体变浑浊，无膜醭，有白色膜状沉淀，有白色絮状沉淀，液体颜色变浅。固体培养特征为菌落呈乳白奶酪状，表面反光，边缘平滑。菌体细胞呈两端出芽，形状为椭圆形、圆形、柠檬形。有子囊孢子形成，每个子囊含1个～4个子囊孢子，孢子呈卵圆形，无假菌丝产生。

2.2 酵母菌理化鉴定

菌株MJ-green-2010的糖发酵实验见表1，碳同化实验见表2，氮同化实验见表3，其他生理生化实验见表4。

表 1 MJ-green-2010菌株糖类发酵的实验结果Table 1 Results of sugar fermentation test by MJ-green-2010 strain

表 2 MJ-green-2010菌株碳源同化的实验结果Table 2 Results of carbon assimilation by MJ-green-2010 strain

表 3 MJ-green-2010菌株氮源同化的实验结果Table 3 Results of nitrogen assimilation by MJ-green-2010 strain

表 4 MJ-green-2010菌株其它生理生化试验结果Table 4 Results of other physiological and biochemical test by MJ-green-2010 strain

2.3 酵母菌分子水平鉴定

酵母菌MJ-green-201026S rDNA近5'端的D1/D2区域PCR扩增产物长度为561bp，PCR扩增产物的凝胶电泳图如图1。

将测序结果在GenBank核酸序列数据库里进行BLAST分析，然后用DNASTAR软件中的MegAlign进行相似性分析及构建系统发育树。所建发育树见图2。

基于26S rDNA D1/D2区域序列和MegAlign分析绘制的系统树。由序列比对结果以及相似性分析，可以得出所测菌株MJ-green-2010与有孢汉逊酵母（Hanseniaspora）属的葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniasporauvarum）的26S rDNA的保守序列的相似性达99%。

3 结论与讨论

在形态方面，首先观察待测菌株的形态是否为酵母菌形态。要进一步区分种，主要依据生理、生化特征及其分子水平的鉴定确定分类地位。注意出芽的各种方式，若产生子囊孢子，则应注意子囊孢子的形状、大小、数目。此外，还应注意是否形成真菌丝和假菌丝。

本实验分离到的MJ-green-2010菌株，经形态和生理生化实验，并根据国际权威的酵母菌鉴定系统[20]鉴定为有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）的葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。PCR扩增产物DNA序列同BLAST比对，菌株MJ-green-2010与有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）的葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）26S rDNA的保守序列的相似性达99%，确定其为有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）的葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。

在绿色树莓果实上存在葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）这种酵母菌，它是一种产酯性能良好的酵母菌，同时也是发酵启动菌，在发酵初期环境比较适合这种酵母菌生长繁殖，将它使用在树莓果酒或者果醋等生产工艺中，可以产生更好的风味，也可以使发酵进行更顺利。

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The Production Ester Yeasts'Screening and Identification of Raspberry Fruit

MA Rong－shan，MU Jing*，WANG Yan－ping
（College of Food，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，Liaoning，China）

The MJ－green－2010 which is the good performance of producting ester was isolated from the green raspberry，after morphological and cultural characteristics，identification of yeast pseudohyphal，physiological and biochemical tests and identification of the molecular level，it was identified as Hanseniaspora uvarum of Hanseniaspora.

Raspberry fruit；product ester yeast；screening；identification

沈阳市科技攻关项目（F10-118-3-00）

马荣山（1960—），男（汉），副教授，本科，研究方向：食品科学、食品生物技术。

*通信作者：穆晶（1986—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

2011-06-29