正交试验法优化香柏（变种）中总黄酮提取工艺

杨梅，王文兰，张嫦，刘东，王晓玲

（西南民族大学少数民族药物研究所，四川 成都 610041）

正交试验法优化香柏（变种）中总黄酮提取工艺

杨梅，王文兰，张嫦，刘东，王晓玲*

（西南民族大学少数民族药物研究所，四川 成都 610041）

研究提取香柏总黄酮的最佳工艺条件。以总黄酮的得率为考察指标，溶剂回流作为提取手段，利用单因素和正交试验，考察提取温度、提取时间、乙醇溶液体积分数、液固比以及提取次数对总黄酮得率的影响。最优工艺条件为：在80℃水浴条件下，提取时间90 min、乙醇溶液体积分数60%、液固比50∶1（mL/g）、提取次数3次。在最优工艺条件下总黄酮的提取率可达7.68 g/100 g。该方法操作方便、准确可靠，可以用于工业化生产。

香柏（变种）；总黄酮；回流提取；正交试验

香柏（变种）[Sabina Pingii（cheng ex Ferre）Cheng etW.T.Wang var.wilsonii（Rehd.）Cheng et L.K.Fu]为柏科圆柏属植物。在我国主要分布于四川、云南、青海、西藏等高海拔地区。马明芳[1]等对香柏植物的水提取物进行过系统的研究，从中分离纯化出13个化合物，其中5个黄酮，2个双黄酮，HPLC分析表明槲皮苷为其主要成分之一。黄酮类化合物具有多种生物活性，如抗溃疡、抗氧化、清除自由基、抗炎、抑菌、血管舒张、抗癌及降血脂等系列生物活性，具有高效低毒的优势，广泛用于医药、食品等行业，具有极广的开发应用前景[2-5]，尤其是植物中黄酮化合物以其纯天然、高活性、见效快等特点得到国内外科研人员的极大关注，目前已开发了多种药用植物黄酮产品[5-6]。因此，研究从香柏中提取黄酮类化合物对香柏的开发利用具有很大的价值。以香柏总黄酮含量为考察指标,采用单因素和正交试验L9（34）法进行实验,对影响提取率的提取温度、乙醇溶液体积分数、提取时间、提取次数及液固比5个因素进行研究，优选出香柏中总黄酮的最优提取工艺条件，为促进该植物的有效开发利用和进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

香柏采自四川阿坝州小金县。

槲皮苷（由西南民族大学少数民族药物研究所313实验室从香柏中分离纯化，结构经质谱、紫外、红外、核磁共振谱进行确认，纯度经HPLC分析达到99.3%），其他试剂均为国产分析纯试剂。

UV-1901紫外分光光度计、METTLER AE240电子天平：北京普析通用；W201恒温水浴锅：SENCO。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制

据相关文献报道[7]，在亚硝酸盐存在时，Al（NO3）3在碱性条件下与黄酮类化合物形成络合物，在一定波长下有稳定吸收峰，以此进行比色分析，标准品选用槲皮苷。

准确称取50℃下真空干燥至恒重的槲皮苷标准品147.6 mg，置于100 mL容量瓶中，加入95%的乙醇溶剂并定容至100 mL，摇匀。用移液管精密量取10 mL置于100 mL容量瓶中，加入95%的乙醇溶剂并定容至100 mL，摇匀得质量浓度0.147 mg/mL的槲皮苷标准品溶液。分别精密量取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL配好的浓度为0.147 mg/mL的槲皮苷标准品溶液，分别置于50 mL容量瓶中，各加入95%乙醇稀释至12.0 mL，加5%NaNO2溶液2.0 mL，摇匀，放置6 min，再加10%Al（NO3）3溶液2.0 mL，摇匀，放置6 min，加5%NaOH溶液20 mL，最后用95%的乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min。以第1瓶为空白液，在500 nm的最佳波长处测定吸光度A值，以A值为纵坐标、槲皮苷的含量（mg/mL）为横坐标作图得标准曲线。用最小二乘法作线性回归，回归方程为y=12.923x-0.0048，r=0.9994。结果表明槲皮苷浓度在0.017 mg/mL～0.040 mg/mL之间呈线性关系，满足含量测定要求[8]。

1.2.2 提取工艺流程

香柏枝叶→自然阴干→粉碎→乙醇回流提取→抽滤→滤液浓缩→香柏总黄酮提取物

1.2.3 单因素条件

分别对提取温度、提取时间、乙醇溶液体积分数、液固比、提取次数进行考察。

1.2.4 正交试验条件

提取黄酮类化合物过程中受多个因素影响，为了得到提取黄酮类化合物的较科学的方法，我们以乙醇-水为提取介质，用回流提取方法，将乙醇溶液体积分数、提取时间、液固比、提取次数作为考察对象设计四因素三水平的正交试验，每个试验重复3次，取平均值作为结果，对回流提取工艺进行优化。因子水平设计见表1。1.2.5 香柏总黄酮含量的测定及提取率的计算方法

表 1 正交因子水平表L9（34）Table 1 The factor levels of design in orthogonal test method

准确称取香柏干粉100.0 g放入1000 mL的圆底烧瓶中，用回流提取，在一定时间、一定乙醇溶液体积分数、一定提取次数、一定液固比的条件下提取；过滤，合并滤液，浓缩，然后用无水乙醇定容至100 mL。准确吸取5 mL提取液，在1.2.1同样的实验条件下，测定样品的吸光度，利用回归方程，进而计算香柏中总黄酮的得率。

香柏总黄酮含量=（提取黄酮的质量/香柏干粉的质量）×100%

2 结果与分析

2.1 香柏黄酮提取工艺单因素试验

2.1.1 提取温度对总黄酮提取的影响

精密称取香柏干粉100.0 g/份，置于1000 mL圆底烧瓶中，以体积分数60%的乙醇溶液作为提取剂，液固比为20∶1，回流提取，提取1次，提取温度分别为60、70、80、90、100℃5个水平，测定总黄酮得率，结果见图1。

图1结果显示，随着温度的升高，总黄酮得率变化不大，基本成一直线，因此提取温度暂定为80℃。

2.1.2 提取时间对总黄酮提取的影响

精密称取香柏干粉100.0 g/份，置于1000 mL圆底烧瓶中，以体积分数60%的乙醇溶液作为提取液，液固比20∶1，回流提取温度80℃，提取1次，提取时间分别为30、50、70、90、110 min 5个水平，测定总黄酮得率，结果见图2。

图2结果显示，回流提取随着时间的延长其提取率不断增加，但在70 min过后,随着时间的延长，其提取率没有明显的变化。其原因在于：由于提取包括扩散、渗透和溶解等过程，时间的增加有助于黄酮类化合物的溶出,从而提取率呈上升趋势，所以提取时间愈长，提取愈完全[9]，70 min以后黄酮提取基本完全，随着时间的增加黄酮提取率变化不大。

2.1.3 乙醇溶液体积分数对总黄酮提取的影响

精密称取香柏干粉100.0 g/份，置于1000 mL圆底烧瓶中，分别用体积分数45%、60%、75%、80%、95%的乙醇作为提取剂，液固比20∶1，回流提取，提取温度为80℃，提取次数为1次，提取时间为50 min，测定总黄酮得率，研究不同乙醇溶液体积分数对总黄酮提取率的影响，结果见图3。

图3结果显示，当乙醇溶液体积分数低于60%时，香柏总黄酮的提取率逐渐增加。其原因可能是在水中溶解度小的黄酮，比如：槲皮苷，柏黄酮等水溶性差醇溶性好的成分，在醇中溶解度大，所以随着乙醇溶液体积分数的增大，香柏总黄酮的提取率呈上升趋势；当乙醇溶液体积分数增大到60%时，提取率最大，此时醇溶性黄酮基本提取完毕，达到动态平衡；当乙醇溶液体积分数再增加时，提取率反而下降，其原因可能是香柏总黄酮中水溶性黄酮较多，所以醇溶液体积分数增加，水含量减少，使得水溶性黄酮的提取率下降，同时乙醇溶液体积分数高，提取液沸点下降过大，同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，与黄酮类化合物竞争和乙醇、水结合，从而导致黄酮类化合物提取率下降[10-12]。故适宜的乙醇溶液体积分数可能为60%。

2.1.4 液固比对总黄酮提取的影响

精密称取香柏干粉100.0 g/份，置于1000 mL圆底烧瓶中，以体积分数60%的乙醇作为提取液，回流提取温度80 ℃，提取1次，液固比分别为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）5个水平，测定总黄酮得率，结果见图4。

图4结果显示，当液固比小于40∶1时，随着液固比的增大提取含量呈上升趋势，并且在液固比为40∶1时，总黄酮提取率达到最大；当液固比高于40∶1时，随着液固比的增大反而呈下降趋势。其原因在于：液固比影响溶剂的极性，从而影响了不同极性黄酮类的溶解性；当液固比越大，乙醇中提取出的总黄酮浓度相对较小，传质阻力较小，有利于原药中黄酮化合物的溶出，但是液固比太大，后续处理时间延长，在较长时间的加热过程中对热不稳定的黄酮可能被氧化、分解等。从而提取率降低。因此适宜的液固比选择在40∶1左右。

2.1.5 提取次数对总黄酮提取的影响

精密称取香柏干粉100.0 g/份，置于1000 mL圆底烧瓶中，以体积分数60%的乙醇作为提取液，液固比40∶1，回流提取温度80 ℃，提取次数分别为1、2、3、4、5次5个水平，测定总黄酮得率，研究不同提取次数对总黄酮提取率的影响，结果见图5。

图5结果显示，香柏中总黄酮的提取率随着提取次数的增加而增大，提取次数越多总黄酮的提取率越高，但提取次数超过3次以后，黄酮得率变化不明显。因此，提取次数以3次左右为宜。

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验结果

正交试验结果，见表2。

表 2 正交试验结果L9（34）Table 2 The results of orthogonal test method

由极差可以确定回流提取影响因素的大小顺序为:B>A>D>C；即乙醇溶液体积分数>提取时间>提取次数>液固比；4种因素组合为A3B1C3D2时提取率最高，为7.68 g/100 g。回流提取最优条件为A3B1C3D2，即提取时间90 min、乙醇溶液体积分数60%、液固比50∶1、提取次数3次。

用SAS统计软件包对实验结果进行方差分析，由于正交试验表中未留空列，没有误差自由度，所以无法进行显著性分析，采取剔除不显著因素C后再进行方差分析[13]，其结果见表3。

由方差分析可以看出提取时间、乙醇溶液体积分数、提取次数在<0.0001均具有一定的显著性，在试验中要注意控制。

表 3 方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test

3 结论

采用单因素及正交试验设计对香柏总黄酮的提取工艺条件进行优化。香柏总黄酮的最佳提取工艺条件为：在80℃水浴条件下回流提取，提取90 min、乙醇溶液体积分数60%、液固比50∶1（mL/g）、提取3次。香柏总黄酮的提取率可达7.68 g/100 g。该提取方法操作简单、准确可靠，可用于工业化生产。

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Optimization of Total Flavonoids Extraction from Sabina pingii（Cheng ex Ferre）Cheng et W.T.Wang var.wilsonii（Rehd.）Cheng et L.K.Fu Using the Orthogonal Test

YANG Mei，WANG Wen－lan，ZHANG Chang，LIU Dong，WANG Xiao－ling*
（Ethnic Pharmaceutical Institute，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，Sichuan，China）

Determine the optimal condition of extraction for total flavones in Sabina pingii（cheng ex Ferre）Cheng et W.T.Wang var.wilsonii（Rehd.）Cheng et L.K.Fu.Extractions of Reflux was investigated.During the extracting process，five main factors including，extraction temperature，processing time，concentration of extracting solution，liquid－solid ratio，extraction times were studied by using single factor analysis method.Based on the single－factor experiment，the best conditions of extracting total flavones were optimized by orthogonal test.The optimums of reflux extraction were：extracted in 80 ℃ water bath，ethanol concentration 60%，processing time 90 min；extraction times 3，liquid－solid ratio 50∶1（mL/g）；under the above conditions，the total flavones yield 7.68%.Those extraction methods were simple，rapid and applicable for the extraction of total flavones in Sabina pingii（cheng ex Ferre）Cheng et W.T.Wang var.wilsonii（Rehd.）Cheng et L.K.Fu.

Sabina pingii（Cheng ex Ferre）Cheng et W.T.Wang var.Wilsonii（Rehd.）Cheng et L.K.Fu；total flavones；reflux extraction；orthogonal test

中央高校基本科研业务费专项资金（No:11NFW02）

杨梅（1986—），女（苗），在读硕士研究生，研究方向：天然药物化学。

*通信作者：王晓玲（1969—），女，副教授，博士，研究方向：天然药物化学。

2011-07-20