参龙健脑胶囊质量标准的研究

白 林, 王 超

（1.解放军总医院药品保障中心药检室，北京 100853；2.大理学院药学院，云南 大理 671000）

参龙健脑胶囊是由人参、地龙、何首乌等药材加工而成的制剂，具有补肾填精、益气活血、健脑益智的功效，适于脑中风及中风后遗症。为建立参龙健脑胶囊质量控制标准，选择方中的主要药味作为质量控制指标进行分析研究。本文采用薄层色谱法对该制剂中人参皂苷Rb1、Re、Rg1，淫羊藿苷，地龙进行鉴别，采用HPLC法对淫羊藿苷的含量测定方法进行研究，现将结果报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（含自动脱气机、四元梯度泵、DAD检测和化学工作站）；超声波清洗器（北京市天海双龙医疗器械有限责任公司）。

人参皂苷Rb1（批号110704-200216），人参皂苷Re（批号0754-200216），人参皂苷Rg1（批号0703-200117），淫羊藿苷(批号110737-200414)，人参对照药材（批号120917-200205），地龙对照药材（批号120987-200405）均来自中国药品生物制品检定所。

参龙健脑胶囊（解放军总医院制备，批号080112、080115、080118）；硅胶G薄层板（100 mm×200 mm，青岛市海化干燥剂厂）；乙腈为色谱纯；甲醇、磷酸等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 人参皂苷的鉴别 取本品10 g，加水5 mL搅匀润湿后，加水饱和的正丁醇25 mL，超声处理20 min，吸取上清液，分别加15、10 mL氨试液洗涤2次，上层提取液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。精密称取人参皂苷Rb1、Re和Rg1对照品，分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为阳性对照品溶液。按处方比例，取缺人参的其他药材，按参龙健脑胶囊制法制备，再按供试品溶液的制备方法制备，所得溶液作为阴性对照溶液。照薄层色谱法[1]实验，分别吸取上述溶液各3 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，阴性对照此处无斑点，结果见图1。

图1 人参薄层色谱图A – UV下TLC图；B – vis下TLC图；1 – 人参皂苷Rb1对照品；2– 人参皂苷Re对照品；3 – 人参皂苷Rg1对照品；4 – 人参药材；5– 样品；6-阴性对照Fig 1 LC of Radix Et Rhizoma GinsengA – under UV; B – under vis; 1 – reference substance of Ginsenoside Rb1; 2 – reference substance of Ginsenoside Re; 3 – reference substance of Ginsenoside Rg1; 4 – crude drug of Radix Et Rhizoma Ginseng; 5– sample; 6 – negative reference substance

2.1.2 淫羊藿苷的鉴别 按“2.1.1”项同法制备供试品溶液。精密称取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为阳性对照品溶液。按处方比例，取缺淫羊藿的其他药材，按参龙健脑胶囊制法制备，再按供试品溶液的制备方法制备，所得溶液作为阴性对照溶液。照薄层色谱法[1]实验，分别吸取上述溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（65 : 35 : 10）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同黄色荧光斑点，阴性对照此处无斑点，结果见图2。

图2 淫羊藿苷薄层色谱图1 – 淫羊藿苷对照品； 2，3，4 – 供试品；5 – 阴性对照Fig 2 TLC of icariin1 – reference substance of icariin; 2,3,4 – samples; 5 – negative reference substance

2.1.3 地龙的鉴别 取本品2 g，加氯仿20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加氯仿1 mL使溶解，作为供试品溶液。取地龙对照药材1 g，加氯仿20 mL，超声处理20 min，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加氯仿1 mL使溶解，作为对照药材溶液。按处方比例，取缺地龙的其他药材，按参龙健脑胶囊制法制备，再按供试品溶液的制备方法制备，所得溶液作为阴性对照溶液。吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，照薄层色谱法[1]实验，以甲苯-丙酮（9 : 1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同黄色荧光斑点，阴性对照无此斑点。结果见图3。

图3 地龙薄层色谱图1 – 地龙对照药材；2 – 地龙药材；3 – 供试品；4 – 阴性对照Fig 3 TLC of Pheretima1 – reference crude drug of Pheretima; 2 – crude drug of Pheretima; 3– sample; 4 – negative reference substance

2.2 . 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适应性实验 色谱柱Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-水-磷酸（30 : 70 : 0.025）。流速：1.0 mL·min-1；检测波长270 nm；柱温40 ℃；进样量：10 μL。淫羊藿苷的保留时间约为11 min，分离度大于3.0，按淫羊藿苷峰计算，理论板数大于6000。

2.2.2 溶液的制备 （1）对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品约0.01 g，精密称定，置5 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。再从中精密吸取0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL含100 μg淫羊藿苷）。（2）供试品溶液的制备：取本品20粒，倾出内容物，精密称定，研细，取约1粒的量，精密称定，置锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，密塞称重，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，再称定重量，以稀乙醇补足损失量，摇匀，过0.2 μm的微孔滤膜，作为供试品溶液。（3）阴性对照溶液的制备：按处方比例，取缺淫羊藿的其他药材，按参龙健脑胶囊制法制备，再按供试品溶液的制备方法制备,所得溶液作为阴性对照溶液。

2.2.3 专属性实验 在“2.2.1”色谱条件下，淫羊藿苷出峰时间在11 min左右，峰形良好，样品中其他成分对测定无干扰。色谱图见图4。

图4 淫羊藿苷色谱图A – 对照品；B– 样品；C– 阴性对照；1– 淫羊藿苷Fig 4 Chromatograms of icariinA – reference substance; B – sample; C – negative reference substance;1 – icariin

2.2.4 线性关系的考察 精密称取淫羊藿苷对照品适量，以甲醇溶解稀释，分别制得每1 mL含淫羊藿苷对照品10、20、40、80、160 μg的溶液，按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，求出回归方程为Y = 20.03X –0.532 0，r = 1.000，结果表明：淫羊藿苷在10 ～ 160 μg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度实验 取“2.2.2”项下淫羊藿苷对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，测定峰面积，RSD = 0.17%。

2.2.6 稳定性实验 取供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、2、4、8、10 h后测定，RSD = 0.67%，结果表明供试品溶液中淫羊藿苷含量在10 h内稳定。

2.2.7 重复性实验 取样品50粒，倾出内容物，研细，混合均匀。精密称取6份，每份约0.5 g。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依上述色谱条件测定含量，RSD = 1.48%。

2.2.8 回收率实验 称取“2.2.7”项下的细粉9份，每份约0.8 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入淫羊藿苷对照品甲醇溶液（高、中、低浓度）2 mL，按“2.2.2”项下方法制备所需供试品溶液，依上述色谱条件测定含量，结果平均回收率为99.5%，RSD =0.96%。具体结果见表1。

表1 加样回收率实验结果. n = 9Tab 1 Analysis of recovery. n = 9

2.2.9 样品含量测定 取不同批次的参龙健脑胶囊，每批样品测定3份，按供试品溶液的制备方法制备，在选定的色谱条件下测定并计算，结果含量为每粒含淫羊藿苷0.862 8 mg，RSD = 0.02%，具体见表2。

2.3 甲醇浸出物的检查

取供试品约4 g，精密称定，置250 mL锥形瓶中，精密加甲醇100 mL，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器过滤，精密量取滤液25mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于150 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定，以干燥样品量计算浸出物不得少于20%。

表2 淫羊藿苷含量测定结果Tab 2 Contents of icariin in samples

3 讨论

采用薄层色谱法鉴别人参，用氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂展开效果不佳，而以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）混合后放置的下层溶液为展开剂分离效果较好。

淫羊藿苷是小檗科淫羊藿属植物中的主要成分，具有免疫调节、抗肿瘤、影响内分泌和心血管系统等多种重要的生物活性[2-5]。用HPLC法测定淫羊藿苷含量，用乙腈-水（30∶70）作流动相[6]，本品的基线不稳定，而以乙腈-水-磷酸（30∶70∶0.025）作流动相基线稳定。对淫羊藿苷对照品在紫外分光光度仪上进行全波长扫描，结果在270 nm处有最大吸收，与文献[7]报道一致。

通过对3批样品淫羊藿苷的测定，本品每粒含淫羊藿苷均在0.86 mg以上。故暂定本品每粒含淫羊藿以淫羊藿苷（C33H40O15）计，不得少于0.70 mg。

本实验建立的TLC色谱系统，具有较好的分离效果，经阴性样品（缺人参、地龙及淫羊藿）实验及样品阳性实验证明，处方其他组分无干扰，鉴别实验成立。采用HPLC法测定淫羊藿中淫羊藿苷的含量，方法简便、结果准确、灵敏度高，整个测试在13 min可以完成，可作为参龙健脑胶囊的质量控制方法。