酸奶中乳酸菌的分离及发酵风味物质测定

张 晶

(三门峡职业技术学院 生化工程系，河南 三门峡 472000)

酸奶中乳酸菌的分离及发酵风味物质测定

张 晶

(三门峡职业技术学院 生化工程系，河南 三门峡 472000)

利用MRS琼脂培养基对酸奶中的乳酸菌进行分离，共分离出A1、S2两株乳酸菌。对两株菌在牛奶中的发酵风味物质进行研究，结果表明：两株菌均有较强的酸度、乙醛和丁二酮生成能力。

乳酸菌；发酵；酸度；乙醛；丁二酮

酸奶是一种传统发酵乳制品，具有丰富的营养价值和良好的保健功能，作为发酵剂使用的乳酸菌，通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。

目前三门峡地区市售发酵酸奶主要采用传统的菌种活化复壮进行生成，营养较为丰富，但菌种质量不易控制，长时间保存后容易出现过酸的现象，因此，了解发酵所用乳酸菌的菌种特性及发酵风味物质特征对于酸奶的品质控制及发酵后熟阶段的储藏和食用有重要指导意义，同时，三门峡地区乳品消费较全省乃至全国，仍处于中下水平，区域奶业发展薄弱，本研究将有助于地方乳品产业发展。

1材料方法

1.1供试样品。

本项目供试样品为三门峡本地凝固型发酵酸奶品牌三隆和阿姆斯。于2011年9月16日分别购买两品牌当日生产批次产品用于项目研究。

1.2仪器试剂。

设备：超净工作台，生化培养箱，电子天平，酸度计，电子显微镜。

培养基：MRS培养基[1]所用化学试剂均为分析纯。

1.3试验方法。

1.3.1乳酸菌分离。

采用平板菌落计数法，以原样、10-1、10-2三个梯度进行平板涂布，分离酸奶中的乳酸菌。

1.3.2乳酸菌理化鉴定。

菌落形态：观察MRS培养基表面菌体生长状况。

生化特征：将纯化后的菌株进行相关生化指标检测，具体方法参照文献。[2,3]

1.3.3乳酸菌发酵性能测定。

将分离到的乳酸菌菌株接种至经巴士消毒的复原乳中，在42℃下发酵至出现凝乳状态，测定发酵过程中发酵液的酸度、丁二酮浓度和乙醛含量，具体测定方法参照文献。[4-6]

2结果与讨论

2.1乳酸菌分离。

在MRS琼脂培养基上，原样、10-1、10-2三个梯度培养皿中，阿姆斯样品仅原样中有菌落生长，菌体数目少且形态单一，三隆样品在三个梯度中均有分布，菌落形态多样。经平板涂布和平板划线分离后，结合显微镜观察及革兰氏染色结果，共筛得A1、S1、S2三株乳酸菌，其中A1由阿姆斯酸奶中筛得,S1、S2分离自三隆酸奶，具体形态见表1。

表1 乳酸菌菌落形态

镜检形态革兰氏染色显示，所分离的三株菌中，A1为革兰氏阳性菌，链球状；S1为革兰氏阴性菌，链球状；S2为革兰氏阳性菌，杆状；具体染色结果见图1。乳酸菌是一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌，因此，所分离到的三株菌中，A1、S2为目标菌株，而S1由于染色结果不符合乳酸菌特征，不再进行后期发酵。将A1、S2纯化后，以试管斜面保藏于4℃。

图1 乳酸菌革兰氏染色图

2.2理化鉴定。

乳酸菌是一类发酵糖类不产H2S、H2O2，葡聚糖、硝酸盐、吲哚实验均成阴性，甲基红实验阳性，精氨酸反应不产氨的细菌。[2]本研究依据上述理化特征，对所分离到的两株菌进行各种理化鉴定，结果见表2。

表2 理化鉴定结果

注：“++”表示阳性结果，“+”表示弱阳性结果，“—”表示阴性结果。

理化鉴定结果显示：葡聚糖产生试验中，A1有较弱的阳性结果，S2为阴性；两株菌在需氧量测定中，A1液体培养基中菌体主要沉淀在试管底部，可以判定为厌氧微生物，S2液体培养过程中菌体在试管中均匀分布，可以判定为兼性厌氧微生物；其他理化特征两者一致。根据理化鉴定结果结合《伯杰氏细菌鉴定手册》，初步鉴定菌株A1为链球菌属，菌株S2为德氏乳杆菌。

2.3发酵性能测定。

乳酸菌发酵分为两个阶段，第一阶段为发酵产酸阶段，在42℃下进行乳糖发酵产酸，当酸度pH达到4.5时，酸奶中的酪蛋白变性沉淀析出，出现凝固结块现象，第二阶段为后酸化阶段，主要是在4℃下保存备用，进行后熟作用。

2.3.1产酸特性。

将所分离到的两株菌A1、S2接入经巴氏消毒牛乳中，充分活化2-3次使菌株活力最大，按照2%的接种量接入100ml经110℃20min灭菌的牛乳中，42℃恒温发酵4-8h，每隔2h无菌取样测定其酸度，以滴定度OT表示。测定结果见图2。

图2 发酵过程酸度变化

从图2可知，两株乳酸菌的酸度值在18-120OT之间，发酵产酸能力上，2h时A1的滴定度为18OT，S2达到22OT；发酵至6h时，A1的滴定度上升到98OT，S2为110OT，到8h接近发酵结束时，A1的滴定度为108OT，S2为120OT，整个发酵过程中，S2菌株的发酵产酸能力始终高于A1菌株，且在S2发酵液中先出现了凝固结块现象，这与酸度测定结果一致。研究表明：乳杆菌的发酵产酸能力要高于嗜热链球菌菌株，[5]本次分离到的两株菌中，初步判定A1为链球菌属，S2为德氏乳杆菌，该结果与相关研究结果一致。

2.3.2乙醛含量。

乙醛是在酸奶制作过程中由保加利亚乳杆菌产生的风味物质之一，pH值降到5.0时开始产生乙醛，在pH值为5.5-4.5之间生成加快，pH值为4.30-4.40时产生速度最大。之后生成量逐渐减少，pH值为4.2时乙醛含量几乎不再产生。[7]发酵第二阶段为风味物质的积累阶段，因此本研究主要对该阶段的乙醛含量进行测定，具体结果见表3。

表3 后酸化阶段乙醛含量(mg/L)

结果显示：A1、S2两株菌均有较强的产乙醛能力，随着后熟时间的延长，乙醛含量逐渐增加，A1菌株发酵产物中乙醛含量在7.41-10.01mg/L之间，S2菌株发酵产物中乙醛含量在9.43-16.44mg/L之间。而乙醛生成量在一定范围内与酸度成正比，酸度越大产量越大。A1的产酸能力要弱于S2菌株，这与酸度测定结果一致。另有研究表明：乳酸菌产乙醛能力与菌体内苏氨酸醛缩酶有关，[8]通常乳杆菌内苏氨酸醛缩酶活性较高，[5]S2菌株为德氏乳杆菌，符合乙醛高产菌特征。

2.3.3丁二酮含量。

丁二酮又名双乙酰，呈奶油香味，发酵乳中丁二酮含量的积累可增加产品的香味。

王伟军等发现[9]:发酵第一阶段有一定量的丁二酮累计，随着发酵时间的延长，双乙酰含量逐渐增加，在较低温度下积累地更快，因此发酵乳中的丁二酮主要来源于后酸化阶段，本研究对发酵第二阶段中的丁二酮含量进行测定，具体测定结果见表4。

表4 后酸化阶段丁二酮含量(mg/L)

结果显示：A1、S2两株菌均有较强的丁二酮生成能力，随着后熟时间的延长，丁二酮含量逐渐增加，A1菌株发酵产物中丁二酮含量在21.54-39.41mg/L之间，S2菌株发酵产物中丁二酮含量在8.35-18.51mg/L之间。研究表明：产丁二酮能力与原料奶中柠檬酸盐含量有关，[8]通常球菌产丁二酮能力较强，[5]A1菌株为链球菌属，符合丁二酮高产菌特征。

3结论

(1)利用MRS琼脂培养基对两种本地品牌酸乳中的乳酸菌进行分离，初步确定A1、S2两株菌为目的乳酸菌，其中A1在分类上属于链球菌属,S2分类地位与德氏乳杆菌相近。

(2)两株菌的发酵特性研究表明，A1、S2两株菌均有较强的酸度、乙醛和丁二酮生成能力，其中A1菌株在发酵产酸阶段产酸能力弱于S2菌株，但在后酸化阶段A1的丁二酮生成能力高于S2；S2的乙醛生成能力高于A1菌株。

[1]乔发东,吴秀芳.高效浓缩乳酸菌发酵剂的制作与应用[J].农牧产品开发,1998(1):25-28.

[2]黄诚,黄群,麻成金，等.湘西传统酸豆角优势乳酸菌分离及鉴定[J].中国酿造，2009(5): 35-38.

[3]凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京: 中国轻工业出版社,1999: 117-129.

[4]李妍,邢慧敏,邵亚东,等.发酵乳中丁二酮和乙醛含量检测方法探讨[J].分析与检测,2008(3) :157-159.

[5]李江,张富新,任娟，等.保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在羊奶中的发酵特性研究[J].陕西师范大学学报(自然科学版),2010(3):91-94.

[6]梅林,王志耕.酸奶、乳酸菌饮料风味及其部分理化特性的研究[J].乳品科学与技术,2004(1):17-19.

[7]王红叶，李丽华，陆淳，等.乙酰、丁二酮对发酵乳风味的影响[J].中国乳品工业,2010(10):32-34.

[8]邢慧敏.少数民族自然发酵乳制品中乙醛高产乳酸菌的筛选及发酵条件的优化[D].内蒙古农业大学食品科学系,2007.

[9]王伟军，李延华，张兰威，等.乳酸乳球菌乳亚种丁二酮变种发酵乳风味物质研究[J].西北农林科技大学学报，2009，37(4):179-183.

ClassNo.:TS252.54DocumentMark：A

(责任编辑：宋瑞斌)

StudiesontheIsolationandFermentationCharacteristicsofLacticacidbacteriainYogurt

Zhang Jing

In this paper,two lactic acid bacteria strains A1, S2 were isolated from the yogurt by the use of MRS agar media. The fermentation characteristics of isolated lactic acid bacteria were analyzed in milk. Results revealed that two strains had high pH, aldehydes and diacetyls production.

lactic acid bacteria; fermentation; pH; aldehyde; diacetyl

张晶，硕士，助教，三门峡职业技术学院。研究方向：食品微生物。

1672-6758(2012)09-0073-2

TS252.54

A