深低温冷冻骨修复兔胫骨缺损的实验研究

郭 华，李龙腾

(郑州铁路职业技术学院，河南 郑州 450052)

各种原因造成的骨缺损的修复与重建是临床骨科的一大难题，目前主要有自体骨移植、人工假体置换、同种异体骨移植以及同种异体骨移植复合人工假体置换等手术方法。选用同种异体骨作为移植物，其临床疗效已得到充分的证实［1－2］，并且同种异体骨移植是外科最早的组织和器官移植手术之一，在临床上仍然有很大的发展空间。新鲜同种异体骨由于具有抗原性引发宿主强烈的免疫反应，导致骨移植延迟愈合或不愈合，而深低温冷冻骨破坏了细胞表面的抗原结构，虽不能完全消灭其抗原性，却可以大大降低其抗原性，使移植后的排斥反应显著降低［3］。本实验通过限定深低温冷冻不同的保存时间，进一步探讨深低温冷冻骨修复骨缺损的效果。

1 材料和方法

1．1 动物分组

实验动物为清洁级2个月龄雄性新西兰大白兔64只，体重(2．2±0．3)kg，由郑州大学医学院实验动物中心提供。其中32只作为制备同种异体骨的供体，其余32只为实验动物受体，随机分为2组:A组16只，植入深低温冷冻3个月骨;B组16只，植入深低温冷冻6个月骨。

1．2 深低温冷冻骨的制备

取新西兰大白兔32只处死，无菌条件下分离右侧胫骨，用线锯从胫骨中上1/3段起截取胫骨约8mm，剔除软组织后，胫骨用无菌盐水进行加压冲洗去除骨髓组织，用甘油浸泡骨组织约30min，然后将骨放入充满15%DMSO(二甲基亚砜)的深低温冷冻瓶，采用逐渐降温法，先放入－4℃的冰箱中，12h后再逐渐降至－80℃，分别于深低温冰箱－80℃保存6个月、3个月，即为深低温冷冻6个月骨和3个月骨。

1．3 动物骨缺损模型的制备与骨移植

3%戊巴比妥钠按1mg/kg行耳缘静脉注射麻醉后，将32只新西兰大白兔取仰卧位，沿右侧胫骨内侧作一约3cm纵形切口，分离胫骨，剥离骨膜。在胫骨中上段用线锯锯断胫骨，制成8mm的胫骨节段性骨缺损模型。将相同长度异体骨段在37℃恒温水浴箱快速复温，并用庆大霉素生理盐水反复冲洗后移植嵌入骨缺损区，修整断端，使骨块对位更理想，并用1．0mm克氏针将异体骨与宿主骨残端的胫骨断端作髓腔内固定。所有兔胫骨缺损模型均由同一组人员完成，骨缺损长度、截骨位置及内固定方法均相同。生理盐水冲洗创腔，切口内撒入青霉素钠800kU，缝合各层，无菌辅料包扎。麻醉清醒后，自由活动，分笼、常规饲养。

1．4 术后处理

术后每只兔肌注青霉素钠400kU，1次/天，共7天。

1．5 观察内容

1．5．1 各组动物一般情况

观察术后动物精神状况、进食、大小便、肢体活动、肢体肿胀、伤口愈合等情况。

1．5．2 骨缺损修复标本大体观察

在2，4，8和12周各时间点A、B组动物分别取4只兔的骨缺损修复标本，观察骨缺损处修复情况以及骨痂生长情况。

1．5．3 组织病理学观察

取移植区标本甲醛固定后，甲酸常规脱钙石蜡包埋切片，苏木精－伊红(HE)染色，Olympus光学显微镜观察组织形态学变化。

1．5．4 检测骨标本的骨密度值

在2，4，8和12周各时间点行标本的骨密度测试。每个时间点A、B组动物取4只，去除克氏针后剔除软组织，采用美国Norland双能X射线骨密度测量仪测量骨缺损区的骨密度，每个标本所选定的测量区的位置、面积均相同。

1．6 统计学分析

采用SPSS10．0统计软件进行分析，实验数据以×—±s表示，组间比较采用配对t检验，P＜0．05为差异有显著性意义。

2 结果

2．1 一般情况

术后3h内所有动物均苏醒，术后1天能站立，伤口周围组织肿胀，淤血，进食正常。术后2周能自由活动，伤口无红肿、渗液等炎性反应，伤口Ⅰ期愈合。动物死亡或移植骨脱出，则补齐实验动物数。

2．2 骨缺损修复标本大体观察

A组。第2周:移植骨、自身骨周围有明显纤维结缔组织包裹，移植骨与自身骨间未出现骨痂，未粘连，界限清晰;第4周:移植骨与自身骨接触端有少量骨痂，界限较模糊;第8周:移植骨与自身骨接触端大部分骨痂明显增多，交界处近连续，分离困难;第12周:移植骨与自体骨界线基本消失，周围骨痂塑型良好，初步骨性愈合。

B组。第2周:移植骨、宿主骨周围有纤维结缔组织覆盖，但移植骨与自身骨间呈游离状态，未粘连，界限清晰;第4周:移植骨与自身骨接触端见少许骨痂生长;第8周:移植骨与自身骨接触端骨痂较前增多，界限模糊;第12周:骨痂明显增多，分离困难，移植骨与自身骨仍未完全愈合，骨缺损区塑形差。

2．3 组织病理学观察

A组:12周时，移植骨与自体骨连接处可见大量成熟骨小梁排列有序致密，连接处的间隙消失，形成新的板层骨结构，大部分皮质骨仍保留原有形态，其中可见扩大的哈佛管和周围软骨的成骨活动(图1)。B组:12周时，移植骨与宿主骨连接处出现稀疏新的骨小梁，排列较紊乱，网眼较大，可见纤维成骨和软骨成骨方式，新形成的哈佛系统较少(图2)。

图1 术后12周A组组织学表现HE×400

图2 术后12周B组组织学表现HE×400

2．4 实验组和对照组各时间点缺损区骨密度值

结果显示:骨密度值A组第8周达高峰，第12周降低;B组在2、4、8、12周骨密度值随时间的增加而升高。A组与B组比较，在2、4周没有显著性差异(P＞0．05)，第8周开始有显著差异(P＜0．05)(表1)。

表1 各时间点2组骨标本的骨密度值

3 讨论

同种异体骨移植在骨与关节肿瘤的保肢治疗及创伤后骨缺损的修复重建中起着重要的作用。同种异体骨移植的愈合过程受同种异体骨的制备、保存过程、手术操作等很多因素的影响。本实验选用新西兰大白兔为实验模型，取骨和保存方法及手术方法与临床应用的方法相同，采用大体标本观察、组织病理学观察、骨密度值的测量等方法完善异体骨移植后愈合过程的观察。大体观察、病理切片结果说明深低温冷冻同种异体骨具有较好的修复骨缺损的能力，但保存时间过长则不利于愈合。原因可能是骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins－2，BMP －2)在深低温冷冻3、6个月骨中表达逐渐下降［4］，6个月骨的BMP－2比3个月骨的BMP－2含量少，且有实验证明BMP－2在骨折愈合和修复过程中发挥着重要的作用［5］，进而骨愈合的进程也比3个月骨慢。

此外，骨密度是一个重要的判断骨强度的指标，是峰值骨量和骨量丢失量二者的综合，能间接反应骨移植愈合的效果。实验中A组和B组深低温冷冻骨标本的骨密度值显示:8周时A组的骨密度值大于B组，有显著差异(P＜0．05)，且A组第8周骨密度值达高峰，说明此时的成骨活动最为旺盛。第12周骨密度值又下降，则提示有骨组织被吸收分解，开始塑性改造。符合大体观察和组织病理学观察到的植入后12周3个月深低温冷冻骨基本达到骨愈合。实验结果与王维彬等［6］的第4～8周骨密度值为高峰结果基本一致。

综上所述，深低温冷冻同种异体骨具有较好的修复骨缺损的能力，是一种较为理想的骨缺损修复材料，但保存时间过长则不利于骨的愈合。

［1］Li D，Bi L，Meng GL，et al．Multi－ variety bone bank in China［J］．Cell Tissue Bank，2010，11(3):233 － 240．

［2］Judas F，Teixeira L，Proenca A．Coimbra University Hospitals’bone and tissue bank:twenty－two years of experience［J］．Transplant Proc，2005，37(6):2799 － 2801．

［3］陈敏，宋建榕，林佳俊，等．深低温冷冻技术对带血管同种异体骨移植作用的实验研究［J］．福建医科大学学报，2006，40(4):378 －380．

［4］夏武宪，郭华，李龙腾，等．深低温冷冻骨的形态学及免疫组织化学检测［J］．中国组织工程研究与临床康复，2011，15(37):6863－6865．

［5］Ahn J，de Gorter DJJ，Prasarn M，et al．Modulation of bone morphogenetic protein antagonists to stimulate clinicaloste ogenesis［J］．Biosci Hypotheses，2009，2(5):322 －325．

［6］王维彬，韩大成，张培训，等．兔胫骨平台骨折愈合中的骨密度变化［J］．中国组织工程研究与临床康复，2011，15(26):4854－4856．